一种蛋白质亲和层析洗脱方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋白质亲和层析洗脱方法，更具体地，公开了一种蛋白质亲和层析洗脱方法，其特征在于，在蛋白A亲和层析蛋白质中，使用低pH(例如3.5-4.0)的柠檬酸和精氨酸缓冲液，洗脱蛋白质主峰并回收。该方法能有效去除聚集体和小分子、降低HCP残留、同时避免抗体亲和洗脱浑浊或沉淀现象产生。本方法不仅仅适用于实验室规模，更可以工艺放大，作为生产工艺。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种蛋白质的亲和层析洗脱方法。
技术介绍
治疗性蛋白，尤其是单克隆抗体的出现给免疫预防和治疗带来突破性的进展，抗 体以其具有理化性状高度均一、生物活性单一、便于工艺放大及质量保证，以及能与抗原良 好的特异性结合，而具有良好的靶向作用等特点，备受亲睐。 亲和层析（affinitychromatographygraphy，AC)是抗体纯化的一种重要的方法， 具有很高的选择性、分离性能以及较高的载量，它通常只需要一步处理即可将某种待分离 的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，是分离纯化蛋白质的有力工具。亲和层析技 术是基于某种蛋白质所具有的生物学特异性，即蛋白质可与另一种称作配体的大分子能发 生特异的可逆结合。所谓的配体是指能被蛋白质所识别并与之结合的原子、原子团或分子。 亲和层析的基本原理是：把待纯化的某种蛋白质的特异配体，通过化学反应共价连接到载 体表面的功能基上构成配基。载体的性能方面允许蛋白质自由通过，当含有目的蛋白的混 合样品加到该配基上时，目的蛋白即和其特异性配体结合而吸附在配体载体的表面，而其 他杂质则被洗出。被特异地结合在配基上的目的蛋白质可通过改变缓冲液的条件使之解吸 附，并进一步收集。（沈同，王镜岩.生物化学第二版 1990, 223) StaphyrococcalProtein(以下简称蛋白A)，来源于微生物的FC受体，其对抗体 的FC区域具有极高的结合能力，并且是可逆的。蛋白A亲和层析常常是抗体药物纯化的 第一步，它是将蛋白A作为配基固定于载体上，能特异性吸附抗体，而不吸附其他杂质，通 过此特点来纯化抗体。 亲和层析虽然能达到很好地捕获抗体的目的，但是在吸附抗体的同时，其它可以 和蛋白A结合的杂质同样也和抗体一样结合在蛋白A上，最终和抗体一起解离下来，从而带 入纯化的抗体中，从而影响抗体的纯度。随着抗体纯化规模的发展，三步纯化，甚至两步纯 化的要求越来越迫切。这就迫切需要一种新的亲和层析洗脱方法，以便进一步提高抗体的 纯度。 为了更好对蛋白质进行纯化，某些抗体在纯化过程中，需在极低pH条件下洗 脱，例如PH3. 0-5. 0,但这很容易改变抗体的高级结构，进而导致频繁发生抗体互相结 合和聚集。酸性条件下抗体的高级结构的改变，已被Biochemistry等人的研究所证实 (Renner,H.Lilie,etal. ,Alternativelyfoldedstatesofanimmunoglobulin,Bioch emistry30 (1991) 6922 - 6929·、或者A.W.P.Vermeer,W.Norde，Thethermalstabilityof immunoglob-ulin:unfoldingandaggregationofamulti-domainprotein,Bio-phys. J.78 (2000) 394 - 404·、或者1(.心1父6，1?.]\^8861￥^2,6.此118(1〇^，1!1〇11116，！1· WelXe,Con-formation,pH-inducedconformationalchange,andthermalunfoldingof anti-p24(HIV-1)monoclonalantibodyCB4-landitsFabandFcfragments,Biochim. Biophys.Actal431 (1999) 120 - 131.)。而抗体的大量聚集情况发生，会使洗脱抗体时很容 易产生浑浊或沉淀。而且抗体经过低pH后，即使马上调节回中性，高级结构的变化也不会 恢复，即该聚集的发生是一个不可逆的过程。为解决这些问题，弓R良辅等专利技术了一种通过 调整pH至4. 0~5. 0同时使用含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的微酸性缓冲液来防止抗 体变性的精制抗体方法，洗脱抗体主峰表现出同PH3. 5的柠檬酸缓冲液相同的回收率【专 利文献：CN200510004669. 6】。 因此，一种能有效去除聚集体和小分子、降低宿主细胞蛋白（Hostcell protein，HCP)残留、同时避免抗体亲和洗脱浑浊或沉淀现象产生的一种抗体精制方法仍是 目前所迫切需要的。
技术实现思路
本申请的专利技术人经过大量研究，专利技术了，其特征在 于，在蛋白A亲和层析蛋白质中，使用低pH值（优选pH3. 5-4. 0)柠檬酸+精氨酸缓冲液， 洗脱蛋白质主峰，并回收。从而提高亲和纯化的蛋白质纯度并解决某些蛋白质低pH洗脱出 现浑池和沉淀现象。具体地： 本专利技术提供了蛋白质亲和层析洗脱方法，蛋白质和蛋白A特异性结合，使用低pH 值（优选pH3. 5-4. 0)的柠檬酸+精氨酸缓冲液作为洗脱液，解离结合在蛋白A上的蛋白 质，从而达到纯化蛋白质的目的。本专利技术中使用的精氨酸优选L-型精氨酸，其水溶性呈强 碱性，使用柠檬酸缓冲液调节洗脱液的pH值，优选pH值为3. 5-4. 0,更优选pH3. 7-3. 9,最 优选PH3. 8,这样洗脱溶液即具备了洗脱能力，又具有一定的缓冲能力，保持洗脱过程中抗 体持续维持在此pH范围；梓檬酸缓冲液的浓度优选40mmol/L-50mmol/L，更优选45mmol/ L_50mmol/L，最优选45mmol/L。精氨酸缓冲液的浓度优选50mmol/L-100mmol/L，更优选 50mmol/L一70mmol/L,最优选 50mmol/L、70mmol/L或 10Ommol/],,上述浓度下是兼具蛋白 质洗脱能力和工艺放大的成本因素，具体可以根据实际需要适当调节精氨酸的浓度。本发 明还提供了一种精纯蛋白质的方法，包括以下步骤：（1)使用中性磷酸盐缓冲液平衡蛋白A 层析柱；（2)将含蛋白质的发酵上清液装载于含蛋白A载体的层析柱上；(3)使用中性磷酸 盐缓冲液平衡层析柱；(4)使用低pH值（优选pH为3. 5-4. 0)的柠檬酸和精氨酸缓冲液 洗脱蛋白质主峰并回收；（5)使用低pH的柠檬酸缓冲液洗脱再生峰。优选地，该方法步骤 (4)中，梓檬酸缓冲液的浓度优选40mmol/L-50mmol/L，更优选45mmol/L-50mmol/L，最优 选45mmol/L ;精氨酸优选L-型精氨酸，精氨酸的浓度优选50mmol/L-100mmol/L，更优选 50mmol/L一70mmol/L,最优选50mmol/L、70mmol/L或10Ommol/],;pH值优选 3.5-4. 0,更优 选pH3. 7-3. 9,最优选pH3. 8 ;另外，优选地，步骤（2)所述载体为含蛋白A的亲和填料，步骤 (5) 所述pH为3. 0以下，更优选pH3. 0。 本专利技术中洗脱液使用的精氨酸主要是L-精氨酸，优选pH为3. 5-4. 0的酸性缓冲 液，柠檬酸缓冲液作为缓冲体系，pH的调节主要使用柠檬酸和氢氧化钠。 本专利技术中使用的载体主要是含蛋白A亲和层析填料，如：GE的rProteinA、MabselectSure填料，上海抗体药物国家工程研究中心的 protein-A±真料等。 本专利技术使用的蛋白质，只要适合于蛋白A亲和层析的蛋白质，例如抗体、结合FC区 域的抗体关联蛋白都可以适用。例如，全人抗体、人源化抗体、嵌合抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质亲和层析洗脱方法，其特征在于，在蛋白A亲和层析蛋白质中，使用低pH值的柠檬酸和精氨酸缓冲液，洗脱蛋白质主峰并回收。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡辉，朱云斌，代波，
申请(专利权)人：上海中信国健药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31