低丰度差异蛋白的分离方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种低丰度差异蛋白的分离方法，包括：获取健康对照组蛋白样品、患者对照组蛋白样品和待测组蛋白样品；将健康对照组蛋白样品作为抗原进行免疫，制备高丰度蛋白多抗，并以该高丰度蛋白多抗为亲和配体制备高丰度亲和层析柱；将患者对照组蛋白样品于高丰度亲和层析柱过柱，收集流穿组份；将流穿组分浓缩后作为抗原进行再次免疫，制备低丰度蛋白多抗；并以低丰度蛋白多抗作为亲和配体制备低丰度亲和层析柱；将待测组蛋白样品于低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分。采用本发明专利技术的过程可以一次直接分离得到正常血浆中含量较多的上调蛋白，降低了分离过程的繁复性，而且直接针对差异表达的低丰度蛋白，具有更高的特异性和针对性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白检测
，具体涉及一种低丰度差异蛋白的分离方法及其应 用。
技术介绍
经过对所有疾病潜伏和发病过程的研宄已经证实，潜在的疾病或潜伏期的生理状 态都已经找到了很好的和生理状态相关的生物标记分子，这些生物标记分子，大多是丰度 较低的蛋白。这些低丰度蛋白在血浆中，都只有很低的浓度，且经常会被白蛋白等高丰度蛋 白，致使在疾病潜伏的前期检测中难以被检测出，大大延迟了疾病的发现时间。所以，差异 性的比较正常及非正常生理状态下的血浆蛋白，并找出相应的生物标记分子，从而辅助疾 病的更早发现具有重要的医学意义。 然而基于上述目的，要差异性的比较正常及非正常生理状态下的血浆蛋白，并找 出相应的生物标记分子，采用目前蛋白质组学的常规检测手段，存在着比较大的困难。原因 在于寻找生物标记蛋白的过程中，要先消除高丰度蛋白对整个系统的掩盖，使很低浓度的 蛋白可以被检测到。目前通常的方法是将所有的蛋白显示在2D电泳胶上，然后对比不同样 本之间的差异蛋白；而其中，首先2D电泳并不能显示出极度酸性或者碱性的蛋白，以及疏 水性较大的脂蛋白；如果蛋白质过多，蛋白斑点的识别也存在着较大的困难；其次血浆中 的高丰度蛋白会掩盖真正具有很重要生物活性作用的微量蛋白，虽然已经有报导各种亲和 方法如CB染料介质、抗体介质等来去除高丰度蛋白，但能去除的蛋白还是很有限，并不能 去除大部分house-keeping蛋白和正常功能蛋白；第三，和非正常生理状态相关的生物标 记蛋白并不局限于低丰度蛋白，有些丰度较高的蛋白也在疾病报道中出现，因此所以仅仅 使用高丰度去除也会导致结果不准确。 基于上述不足，本案的专利技术人早先于2010年在CN102430176A号专利中提出了一 种对待测蛋白和对照蛋白之间的差异蛋白进行富集，从而提升待测蛋白或者多肽浓度的方 法。其技术实现的过程采用将标准对照蛋白作为抗原进行免疫，制备得到能够与该对照样 品中的至少一种蛋白或多肽结合的免疫球蛋白（其实就是以标准对照蛋白作为抗原产生 的一抗抗体，属于多克隆抗体），然后用该免疫球蛋白制成亲和介质的层析柱，用来吸附待 测样品中的大量高丰度蛋白，从而流穿组分即为富集浓缩的待测蛋白中的低丰度差异蛋 白。 但是这一早先的做法中，采用正常对照蛋白通过免疫制备得到抗体，对照蛋白本 身采用的是正常蛋白，所分离和浓缩得到的低丰度蛋白只是新出现或上调的潜在标志蛋 白，而无法进一步直接确定这些蛋白的表达是属于非正常血浆中的下调蛋白或者是正常血 浆中含量较多的上调蛋白，需要进一步的在采用对比进行大量的对比检测，增加繁复步骤 之后降低了准确性，提升了工作量，使得上述方法实施中存在不足。
技术实现思路
本专利技术实施的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够直接分离富集非 正常血浆中的低丰度下调蛋白的。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下： -种低丰度差异蛋白的分离方法，包括如下步骤： 获取健康对照组蛋白样品和患者对照组蛋白样品和待测组蛋白样品； 将健康对照组蛋白样品作为抗原进行免疫，制备高丰度蛋白多抗；并以所述高丰 度蛋白多抗为亲和配体与固相基质制备高丰度亲和层析柱； 将患者对照组蛋白样品于所述高丰度亲和层析柱进行过柱，并收集流穿组份； 将所述流穿组分浓缩后作为抗原进行免疫，制备低丰度蛋白多抗；并以所述低丰 度蛋白多抗作为亲和配体固定与固相基质制备低丰度亲和层析柱； 将待测组蛋白样品于所述低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分。 本专利技术在上述低丰度差异蛋白的分离方法的基础上，还提出一种上述低丰度差异 蛋白的分离方法在低丰度差异表达蛋白检测上的应用。 本专利技术的低丰度差异蛋白的分离方法和应用，在原先方法的基础上，先用健康组 的蛋白进行一次免疫，制备能用来滤除大量背景高丰度差异蛋白的高丰度多抗，然后用该 高丰度蛋白多抗制备高丰度蛋白层析柱去除非正常患者差异表达蛋白样品中的背景高丰 度蛋白，收集的流穿组分即为非正常患者差异表达的低丰度蛋白；然后将该流穿组分浓缩 之后作为抗原去进行第二次免疫，得到低丰度差异表达的多抗，之后再用该低丰度差异表 达的多抗作为配体进一步制备低丰度差异蛋白的层析柱，便可以直接一次分离待测组蛋白 样品中属于非正常血浆中的下调蛋白或者是属于正常血浆中含量较多的上调蛋白。整体过 程可以一次直接分离得到正常血浆中含量较多的上调蛋白，降低了分离过程的繁复性，提 升了分离和检测效率，而且最后的洗脱组分直接针对差异表达的低丰度蛋白，具有更高的 特异性和针对性。【附图说明】 下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中： 图1为本专利技术实施例分别采用正常人血浆和另一名肝癌患者血浆分别作为待测 蛋白按照上述步骤检测获得的洗脱液进行SDS-PAGE电泳银染的图片。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并 不用于限定本专利技术。 本专利技术实例提出一种低丰度差异蛋白的分离方法，包括步骤概括如下： S10,获取健康对照组蛋白样品、患者对照组蛋白样品和待测组蛋白样品； S20,将健康对照组蛋白样品作为抗原进行第一次免疫，制备高丰度蛋白多抗； S30,将步骤S20获得的高丰度蛋白多抗作为亲和配体，固定至层析柱的固相载体 上，制备高丰度亲和层析柱； S40,将患者对照组蛋白样品用步骤S30制备的高丰度亲和层析柱进行过柱，收集 流穿液； S50,将步骤S40收集的流穿液进行浓缩之后，作为抗原进行再次免疫，制备低丰 度蛋白多抗； S60,将步骤S50获得的低丰度蛋白多抗作为亲和配体，固定至层析柱的固相载体 上，制备低丰度亲和层析柱； S70,将待测组蛋白样品于步骤S60所制备的所述低丰度亲和层析柱进行过柱，并 收集洗脱组分。 本专利技术的低丰度差异蛋白的分离方法，在原先方法的基础上，先用健康组的蛋白 进行一次免疫，制备能用来滤除大量背景高丰度差异蛋白的高丰度多抗，然后用该高丰度 蛋白多抗制备高丰度蛋白层析柱去除非正常患者差异表达蛋白样品中的背景高丰度蛋白， 收集的流穿组分即为非正常患者差异表达的低丰度蛋白；然后将该流穿组分浓缩之后作为 抗原去进行第二次免疫，得到低丰度差异表达蛋白的多抗，之后用该低丰度差异表达蛋白 的多抗作为配体进一步制备低丰度差异蛋白的层当前第1页1 2 3 4 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低丰度差异蛋白的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：获取健康对照组蛋白样品、患者对照组蛋白样品和待测组蛋白样品；将健康对照组蛋白样品作为抗原进行免疫，制备高丰度蛋白多抗；并以所述高丰度蛋白多抗为亲和配体与固相基质制备高丰度亲和层析柱；将患者对照组蛋白样品于所述高丰度亲和层析柱进行过柱，并收集流穿组份；将所述流穿组分浓缩后作为抗原进行再次免疫，制备低丰度蛋白多抗；并以所述低丰度蛋白多抗作为亲和配体固定与固相基质制备低丰度亲和层析柱；将待测组蛋白样品于所述低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张贯京，李荣秀，邓立，肖华，克里斯基捏·普拉纽克，艾琳娜·古列莎，波达别特·伊万，张舒林，
申请(专利权)人：深圳市贝沃德克生物技术研究院有限公司，深圳市华科安测信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44