用于早期糖尿病诊断的多肽标志物制造技术

本发明专利技术提供了用于早期糖尿病诊断的多肽标志物，首先选择人外周血高丰度蛋白HSA建立体外模拟糖基化模型，优化条件下酶切，将酶切后的空白对照组样品进行18O标记，与采用16O平行处理的反应组样品1:1(v/v)混合，进行HPLC/ESI-TOF MS检测。通过对HSA肽段的定量分析，找到最不易被葡萄糖修饰的肽段如SEQ ID NO.1所示，作为内标肽段，将易发生糖基化修饰的肽段与内标肽段峰面积之比用以衡量葡萄糖敏感肽的糖基化修饰程度，通过蛋白质组学方法最终发现3条肽段FKDLGEENFK、LDELRDEGK和KVPQVSTPTLVEVSR可作为生物标志物用于糖尿病的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了用于早期糖尿病诊断的多肽标志物，首先选择人外周血高丰度蛋白HSA建立体外模拟糖基化模型，优化条件下酶切，将酶切后的空白对照组样品进行18O标记，与采用16O平行处理的反应组样品1:1(v/v)混合，进行HPLC/ESI-TOF?MS检测。通过对HSA肽段的定量分析，找到最不易被葡萄糖修饰的肽段如SEQ?ID?NO.1所示，作为内标肽段，将易发生糖基化修饰的肽段与内标肽段峰面积之比用以衡量葡萄糖敏感肽的糖基化修饰程度，通过蛋白质组学方法最终发现3条肽段FKDLGEENFK、LDELRDEGK和KVPQVSTPTLVEVSR可作为生物标志物用于糖尿病的早期诊断。【专利说明】用于早期糖尿病诊断的多肽标志物
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及用于检测早期糖尿病的多肽标志物及其应用。
技术介绍
糖尿病是一组以慢性血葡萄糖(简称血糖)水平增高为特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起。目前，医学上将空腹血糖和糖化血红蛋白水平作为临床诊断糖尿病的直接标准。但对于糖尿病前期的人群来讲，血糖水平并不会明显率先表现出居高不下的状态，而是由于肌体对血糖水平调节能力的下降，表现为血糖水平的忽高忽低。糖化血红蛋白的测定则通常反映人相对长期(8-12周)的血糖状况。通常情况下一旦空腹血糖和糖化血红蛋白的水平达到了病理值，则“患有糖尿病”的结论不太可能出现逆转。虽然胰岛素及其它药物在很大程度上使糖尿病及其并发症得到了有效的控制，但目前糖尿病尚不能完全治愈，因此早期诊断对于糖尿病的治疗起着至关重要的作用。目前，医学上将空腹血糖和糖化血红蛋白的水平定义为临床诊断糖尿病的直接标准。空腹血糖大于等于7.0mmol/L或者糖化血红蛋白水平大于等于6.5%即可诊断为糖尿病。尽管这一标准是现行权威的诊断标准，但由于性别、年龄，家族病史等不同个体差异的影响，单次空腹糖或糖化血红蛋白水平偏高并不能百分之百的准确预测所有的糖尿病病例，尤其在该疾病的早期阶段。在这种情况下，其它生物标志物的发现和研究应用于糖尿病的早期诊断越来越受到人们的重视。生物标志物可用于监测一个生理或者病理的过程，也可以用于跟踪一个药理反应，一个理想的生物标志物能够鉴定疾病发展的程度、也可有效提高疾病预警的准确性，还可指导疾病的治疗，甚至可以帮助研究人员洞悉疾病的发病机制。人的血浆蛋白来源于各种组织或细胞的分泌或者泄漏，已有研究表明血浆蛋白的动态变化反映了人的生理或病理状态的变化，因此血浆蛋白质组的变化能很好地指示机体生理或病理状况。血浆蛋白执行着人体的许多生物功能，在人类健康与疾病中有着重要的意义，人类的很多疾病都会引起血浆中蛋白质性质和含量的改变。由于血浆取材容易，且血浆中蛋白具有许多重要的生理功能，血清中某种蛋白浓度的变化往往预示某些疾病的发生。因此，监测血清蛋白浓度对于疾病的早期诊断、病因的阐明及药物疗效的监测方面都具有重要的意义。早期发现的某种蛋白在表达数量、水平及修饰状态上出现的差异，很有可能作为疾病诊断的重要生物标志物。在蛋白质组学中，最常用的鉴定蛋白的方法之一是基于二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)技术和质谱联用，通常在一块胶上可以使几千个蛋白得到分离，由于其第一维是等电聚焦，采用PH梯度根据蛋白质等电点的不同使之分离，第二维是聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量的大小进行分离，故可直接反映不同蛋白质的等电点和分子量的信息，而且也能反映蛋白质异构体和翻译后修饰等变化。由于2DE是在蛋白水平上进行定量，该技术存在自身难以克服的缺陷，故人们转向在肽段水平上进行定性和定量，进而实现蛋白的定量。基于质谱技术的定量方法大体上可以分为两种，一种是无标记定量技术，另外一种是同位素标记定量技术。基于同位素标记定量技术主要包括体内代谢标记和化学标记两种。体内代谢标记指生物体的外界培养环境中某一种元素或者氨基酸被某一同位素所取代，这样在生物体生长的过程中，同位素逐渐取代自身的天然元素或氨基酸，在蛋白水平或肽段水平上形成质量差。代谢标记主要包括细菌或细胞的15N标记法和细胞培养中氨基酸稳定同位素标记法(Stable Isotope Labeling byAmino acids in Cell culture, SILAC)。目前绝大多数生物标志物均处于蛋白水平，常见的检测手段为酶联免疫吸附法(ELISA)0酶具有较高的催化效率，因此ELISA法具有较高的灵敏度，但该方法需要预先知道生物标志物及其相应的特异性抗体，在实际应用中存在一定的挑战。鉴于此，近年来以质谱为基础的定量蛋白质组学的方法越来越多被应用与生物标志物的寻找。然而，与蛋白类生物标志物相比，肽类生物标志物可能更便于采用质谱进行检测，其原因在于，蛋白在体内可能经历多种翻译后修饰，如:磷酸化、糖基化、乙酰化等等。每一种翻译后修饰都可能改变蛋白的分子质量，从而导致质谱这一基于对分子量进行测定的仪器在检测上的困难。相反，若采用多肽作为生物标志物则不存在这个问题。近年来，糖尿病及其并发症的生物标志物逐渐成为研究的热点之一，目前已经有许多糖尿病生物标志物被广泛报道，例如C反应蛋白、丙氨酸转氨酶、甘油三酯等。这些生物标志物的发现和检测为早期糖尿病及其并发症的发现和治疗提供了有利依据。但在一般情况下，分析过程中的需要添加内标物使得待测物质得以准确定量。但是内标物的寻找也常常成为分析方法的难点之一，主要因为对内标的选择有诸多要求，如:内标物添加至样品中能完全溶解、不与待测组分发生反应，且内标物与待测组分在色谱保留时间上应尽可能接近。若能解决内标肽段溶解性差且容易与其他肽段存在相互反应的问题，对于下一步筛选葡萄糖敏感肽段的糖尿病多肽标志物，用于糖尿病的早期诊断具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种人外周血蛋白HAS中对葡糖糖不敏感的内标肽段。本专利技术的第二个目的在于提供用于糖尿病早期诊断的多肽标志物。本专利技术的第三个目的在于提供一种基于质谱技术的早期糖尿病诊断试剂盒。本专利技术提供的用于检测早期糖尿病的内标多肽，其来源于人血清白蛋白，具有SEQID N0.1所述的氨基酸序列，m/z=977.4。本专利技术提供了上述内标多肽在制备早期糖尿病诊断试剂盒中的应用。本专利技术提供了一种筛选上述内标多肽的方法，包括以下步骤:(I)体外糖基化样品的制备，将无菌HSA于50mM pH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液，分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415 ;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照；所述HSA的生理浓度为40mM/mL。(2)胰酶消化，将蛋白样品溶于50mM pH8.3的NH4HCO3缓冲液中，向每200μ g经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μ L含8M尿素的IOmM DTT(二硫苏糖醇)溶液进行变性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mM IAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于早期糖尿病诊断的内标多肽，其特征在于，其来源于人血清白蛋白，具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：邓玉林，张玫，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11