一种低丰度蛋白靶上一步除盐与富集的方法技术

本发明专利技术是一种通过疏水性聚合物微印迹技术与基质辅助激光解析离子化质谱联用，进行痕量蛋白或多肽的靶上一步除盐与富集的方法。微印迹的疏水性聚合物对蛋白质和多肽有很好的吸附富集效果，但是对无机盐和其他污染物吸附很少，利用固体表面液珠蒸发过程中的外流作用，被疏水性聚合物吸附的样品无需额外的洗脱除盐步骤就可实现除盐并直接进行ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析。本发明专利技术不仅成功实现了样品一步除盐与富集，而且具有灵敏度高、重现性好、通量高、耐盐能力强、经济和省时等特点，可广泛用于蛋白质组学领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生化分析
，具体涉及一种痕量样品除盐和富集的方法。
技术介绍
伴随着人类基因组计划(HGP)的顺利实施，人们认识到功能基因组学重在提示基因的生物学功能，在基因组整体水平上阐明基因活动的规律，而基因仅仅是遗传信息的载体，而生命活动的执行者和体现者是基因的表达产物---蛋白质。后基因组时代中，生命科学的中心任务则是阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能，即生命科学的研究中心将从基因组学转移到蛋白质组学(Proteome)。蛋白质组比基因组复杂的多，蛋白质组学的发展不仅需要包括数据库整合在内的新技术的发展和新实验战略的建立，而且还需要学科转移和跨学科合作的精神。随着新技术的整合极其广泛扩散以及各个领域的科学计划之间的广泛合作，人类以及各种模式生物基因组测序计划开始时确定要完成的任务必将取得最终的实现。蛋白质组学研究主要包括样品或组织中的蛋白质分离和鉴定两个关键步骤。生物质谱随着新的软电离方式——基质辅助激光解析离子源(MALDI)的广泛应用已经成为蛋白质组学技术平台中最为重要的技术手段。日本科学家田中耕一先生正是因为专利技术了MALDI而荣获2002年诺贝尔化学奖。因为蛋白质组是一个在时间和空间动态变化着的整体，样品体系及其复杂，蛋白动态分布范围非常广，在样品预处理过程中必须加入一些表面活性剂、去垢剂、尿素等溶剂来增加蛋白的溶解度，随之带来的问题是这些杂质或盐分会大大降低蛋白或肽段的质谱信号，使样品收集不到足够的质谱鉴定信息，所以除盐是蛋白质组学研究工作中必须用到的处理步骤；而蛋白质组样品中高中低丰度蛋白分布广泛，低丰度蛋白又往往担负着生物体内各种重要的生理功能，它的有效分离与检测目前是国际难题，因为样品处理有很多步骤，寻找富集低丰度蛋白有效方法的同时也要简化步骤以减少器皿内壁对蛋白样品的吸附，除盐也是目前提高低丰度蛋白检测灵敏度的有效手段。蛋白质组研究的进一步拓展和深入，尤其是对低丰度蛋白质的分析鉴定已经对MALDI技术提出越来越高的要求。现有的MALDI技术由于仅依靠有机基质辅助样品离子化，这样由于溶剂扩散程度的不同、金属靶板表面的微区多样性、溶剂挥发时间不同、基质和样品的溶解性不同、以及盐和其它无机杂质的干扰等因素而导致质谱检测样品灵敏度低和重复性差，这给低丰度蛋白质的检测造成了屏障。科学家一方面在寻求新型的基质，如无机基质和离子液基质，试图彻底改善样品和基质的分布来实现MALDI信号的定量化；另一有效途径是科学家们发展了聚合物印迹样点技术以实现提高样品检测灵敏度和重复性。早期的做法是用聚合物涂层作为吸附固定相，这样虽然在复杂体系下吸附了蛋白或肽消除了盐和表面活性剂的干扰，但是对蛋白或肽的吸附量非常有限，不符合低丰度蛋白的检测要求；另一传统的做法是用印迹方法在金属靶的非点样部分表面自组装上一层非极性分子，而在点样部分涂覆极性聚合物，把肽样品点覆在极性聚合物涂层上后再用水洗掉表面活性剂和盐，最后再点加基质。这样不但水洗过程需要一定的经验技术，否则会照成盐洗脱不充分或样品被洗脱而损失，并且影响了分析过程的高通量和高速度，不太适合蛋白质组学规模化的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、重现性好的对痕量蛋白或多肽样品进行靶上一步除盐和富集并直接进行质谱分析的方法。本专利技术提出的对痕量蛋白或多肽进行靶上一步除盐和富集的方法，具体步骤如下1、首先用疏水性聚合物在MALDI靶板每个样品池的中央部位形成均匀印迹涂层。2、利用制作的疏水性聚合物微印迹涂层进行痕量蛋白质或多肽的靶上一步除盐和富集工作。将多肽或蛋白样品0.3～1.0微升点覆在疏水性聚合物印迹涂层上，室温自然干燥，由于蛋白质或多肽与疏水性聚合物有很强的疏水性相互作用，从而被富集在印迹涂层表面。3、将稍过量体积的有机基质溶液(例如4～10mg/mL的2-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA))点覆在带有上述样品的疏水性聚合物印迹涂层上。由于疏水性聚合物对蛋白质或多肽具有强吸附作用而对无机盐等污染物具有弱吸附作用，并且固体表面的液滴干燥过程中在液滴内部具有外流作用，所以过量的基质溶液会携带无机盐等与疏水性聚合物弱吸附的污染物、并扩散出印迹涂层至周围的不锈钢靶板区域。室温自然干燥后，印迹涂层表面形成样品和基质均匀细致的结晶。4、被富集的样品无需额外洗脱除盐步骤，直接用激光激发印迹涂层表面进行MALDI-TOF-MS分析，(即基质辅助激光解析离子化质谱分析)。5、根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。上述方法中，步骤1中形成疏水聚合物印迹涂层的具体操作如下(1)在一定厚度(例如35-50微米)的Kapton粘性膜(杜邦公司)上按照MALDI靶的形状和样品池位置、使用红外激光精确定位打孔，使Kapton膜上形成与靶样品池位置对应的、直径为池直径一半的小孔，并黏在MALDI靶的表面；(2)将0.2微升疏水性聚合物溶液(10-18mg/mL，溶于四氢呋喃)点覆于每个Kapton膜的小孔内，溶剂迅速挥发，将Kapton膜揭去，MALDI靶板每个样品池内形成均匀的疏水性聚合物微印迹涂层。本专利技术的疏水性聚合物微印迹MALDI样点技术，可以非常有效的实现样品一步除盐和富集的效果，并且无需额外的水洗过程就能达到提高检测肽段灵敏度的目的。1997年NATURE上有科学家报道固体表面的、处在挥发过程中的液滴内部存在“Outward Flow”的过程(外流过程)，我们巧妙的利用这一自然现象，首先将疏水性聚合物微印迹在MALDI-MS靶板每个样品池的中央，再把样品点覆在聚合物涂层上，室温自然干燥后将稍过量体积的基质溶液点覆其上，由于液滴内部“Outward Flow”把无机盐等杂质源源不断带到样品池外圈的不锈钢表面上，而蛋白质或肽段由于和聚合物表面存在疏水性相互作用力而仍被浓缩在聚合物表面上和基质形成均匀的共结晶，从而实现了样品一步除盐与富集技术。然后将靶板送入MALDI-MS，用激光直接激发印迹涂层表面即可获得高灵敏度、高重现性的质谱信号。本专利技术由于样品的样点面积相比传统方法缩小了，而且在平整的聚合物表面上样品分子与基质分子更容易形成细小、均匀的共结晶，这样在每次脉冲激光的激发下样品分子更容易被大批量的解析离子化，从而提高体系的灵敏度和重现率。本专利技术使用的疏水性聚合物可以是聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲脂及其C60富勒烯官能团衍生物，它们都是世界上首次应用于MALDI-MS靶板涂层。本专利技术还可使用硝基纤维素、聚乙烯、聚二氟乙烯、聚氨基甲酸酯、Nylon、Teflon等疏水性聚合物作为印迹涂层。本专利技术的疏水性聚合物分子量为1万至5万道尔顿较为合适，线性、星形聚合方式都适用，其中，疏水性强的聚苯乙烯(PSt)要比疏水性次之的聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)灵敏度高，进行了C60富勒烯官能团衍生化的聚合物要比未衍生的同源聚合物灵敏度高，原因在于(1)聚合物疏水性越强，与蛋白质或多肽的疏水性相互作用越强，除盐能力就越强；(2)C60富勒烯官能团能有效地吸收紫外激光并把能量传递给基质和样品分子，提高其解吸化的效率，从而提高样品检测灵敏度。聚合物性质表 本专利技术不仅成功实现了样品一步除盐与富集，而且具有灵敏度高、重现性好本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低丰度蛋白靶上一步除盐与富集的方法，其特征在于具体步骤如下：（１）首先用疏水性聚合物在ＭＡＬＤＩ靶板每个样品池的中央部位形成均匀印迹涂层；（２）将０．３～１．０微升多肽或蛋白样品点覆在疏水性聚合物印迹涂层上，室温自然干燥 ，由于蛋白质或多肽与疏水性聚合物有很强的疏水性相互作用，从而被富集在印迹涂层表面；（３）将过量体积的有机基质溶液点覆在带有上述样品的疏水性聚合物印迹涂层上，过量的基质溶液会携带无机盐等与疏水性聚合物弱吸附的污染物、并扩散出印迹涂层至 周围的不锈钢靶板区域，室温自然干燥后，印迹涂层表面形成样品和基质均匀细致的结晶；（４）被富集的样品直接用激光激发印迹涂层表面进行ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析；（５）根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾韦韬，陆豪杰，吴慧霞，蔡瑞芳，杨芃原，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]