一种基于新型纳米复合材料的蛋白质组样品预处理方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种新型纳米复合材料用于蛋白质样品预处理的新方法。该材料用于蛋白质样品预处理能够有效减小高丰度蛋白质的丰度，降低样品的复杂程度，鉴定到血浆中更多的中低丰度蛋白质。相比于传统的蛋白质样品预处理方法，具有方便易行、成本低廉等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于新型纳米复合材料的蛋白质组样品预处理方法及其应用
本专利技术涉及蛋白质样品预处理方法，具体地说是一种基于聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物的制备及其在蛋白质样品预处理中的应用。
技术介绍
生物样品内蛋白质的组成极其复杂，而且动态范围比较宽，浓度差异大（丰度差异大），比如血浆样品中前10种高丰度蛋白质含量占到总蛋白质含量的90%，前22种蛋白质占到99%，余下几千种蛋白却仅占到1%，高丰度蛋白质的存在会掩盖低丰度蛋白质，从而干扰对低丰度蛋白质的鉴定，而这些低丰度蛋白质往往存在潜在的生物学意义，在疾病标志物的发现与治疗方面可能会发挥重要生物功能（J.ProteomeRes.,2011,10,516）。因此在蛋白质样品分析过程中需要降低其中高丰度蛋白质的丰度差别，缩小这种差异以方便用现有的检测技术检测到低丰度蛋白质成为蛋白质样品预处理的核心问题之一。目前发展的去除高丰度蛋白质的技术方法主要包括染料配体法、超速离心过滤法、免疫去除法及预分级技术。染料配体法是将汽巴蓝F3GA及其衍生物固定在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒表面，通过染料跟白蛋白的相互作用去除人血清白蛋白(JournalofChromatographyB,2006,832,216-223)。该方法样品的处理量大，但特异性较差。超速离心过滤法主要通过选择具有不同截留分子量的膜实现蛋白质的分离，并去除某些分子量较大的高丰度蛋白质（Molecular&CellularProteomics,2003,2,10961103）。然而高丰度蛋白质并非都是大分子量的蛋白质，因此会存在对高丰度蛋白质去除不充分，而且可能会同时去除高分子量的低丰度蛋白质等问题。与前两种去除方法相比，免疫去除法的特异性很高(MolCellProteomics2008,7,1963-1973;JProteomeRes2010,9,4982-4991;JProteomeRes.,2007,6,947-954)。然而，该方法仍存在很多不足，如，低丰度蛋白质易与部分高丰度蛋白质非特异性结合，产生共去除现象(Electrophoresis2010,31,471-482)；已发现的抗体种类少(20种)；处理样品的体积有限；去除后的样品被稀释；不同蛋白质去除效率有一定差异性等。近期，人们还通过采用液相等电聚焦和多维液相色谱等方法进行样品的预分级，有效地降低了样品的复杂程度(J.ProteomeRes.,2009,8,11431155;Electrophoresis,2009,30:249-261;Electrophoresis,2010,31,35803585;J.ProteomeRes.,2009,8,11431155;J.ProteomeRes.,2010,9,1902-1912)。但是液相等电聚焦方法只能根据已有的等电点膜将样品按照有限的等电点区间进行分级。因此，高丰度蛋白质所在级分仍存在对低丰度蛋白质的掩盖问题。而多维液相色谱方法不仅操作繁琐、运行时间长，而且也难以避免去除高丰度蛋白质的同时造成低丰度蛋白质的共洗脱。
技术实现思路
针对以上方法目前存在的不足，本专利技术提供一种简便高效的蛋白质样品处理方法以降低蛋白质样品的复杂程度。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：在不同pH条件的缓冲溶液中，采用聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒处理蛋白质组样品，以降低蛋白质组样品中高丰度蛋白质的丰度，并同时实现蛋白质组样品复杂程度的降低。所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒的制备与蛋白质样品处理的具体步骤如下，（1）样品处理方法中所述的材料聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒的制备：将氧化石墨烯分散于水中，超声使其分散均匀。加入与氧化石墨烯质量比为10-1000倍的聚亚乙基亚胺（PEI），室温震荡反应5min-70min后，加入与聚亚乙基亚胺质量比为1/5-1/100的氯金酸（HAuCl43H2O），震荡均匀，30-100℃反应5-90min。双蒸水反复洗涤后，离心并分散于100μL水中。向200-500μL上述颗粒中加入25-100mgSH-PEG溶液，水溶液体系中反应2-24h，水洗涤即制得聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒。（2）体液样品包括血液和尿液样品；组织样品包括动物组织样品如动物大脑、心脏、肺、胃、肝脏等组织样品；细胞样品如Hela细胞样品、类淋巴母细胞等细胞株样品。（3）蛋白质样品的处理：采用（1）制备的纳米复合物颗粒与蛋白质样品在pH值为3-10的缓冲溶液中孵育0.5-10h，孵育温度为1-40℃。（4）蛋白质洗脱：将颗粒去除上清液后，采用与(2)中孵育溶液相同的缓冲液进行洗涤，去除上清液，得到纳米复合材料与蛋白质的复合物。（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（SDS-PAGE）向（3）中所述纳米复合材料与蛋白质的复合物中加入同等体积的SDS-PAGE上样缓冲溶液，在沸水中煮沸后，将其加于凝胶孔道中。采用5%浓缩胶和12%的分离胶，在120V恒压条件下进行分离。（6）蛋白质酶解：将（3）中得到的纳米复合材料与蛋白质的复合物在50-100℃的溶液条件下加热变性，再分别进行胰酶酶解。具体过程如下：向变性后的复合物中加入二硫苏糖醇反应1.5h，实现蛋白质的还原过程，再加入碘乙酰胺溶液，避光条件下反应40min对蛋白质进行烷基化，最后加入与蛋白质质量比为25:1-50:1的胰蛋白酶，37℃进行酶解反应16h。离心后收集上清。（7）二维液质联用分析与数据处理：将上述蛋白质酶解产物进行强阳离子交换-反相液质联用(SCX-RP-LC-MS/MS)分析。质谱数据采用Mascot检索。本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术所采用的样品处理方法能够有效降低样品中高丰度蛋白质的丰度，降低复杂样品的复杂程度；（2）制备的颗粒稳定，制备方法与样品处理结果重现性好，；（3）样品处理方法耗费少，操作简便，通过离心操作便能实现，不需要液相色谱、电泳仪等仪器辅助，且无需使用抗体柱等。附图说明图1为聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒透射电镜图图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质样品结果图具体实施方式下面采用具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步说明。实施例11.材料表征制备的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒透射电镜结果表征如图1所示，根据该图可看出纳米金颗粒在石墨烯层中分散均匀，说明石墨烯层上修饰的聚亚乙基亚胺成功还原氯金酸溶液，在其表面生成纳米金颗粒，并且材料具有很好的分散性。2.样品处理过程将制备的纳米复合物颗粒与血浆蛋白质样品在pH值为4.0,7.4,9.0的三种磷酸缓冲溶液中孵育0.5h，孵育温度为25℃。将颗粒离心去除上清液后，采用与孵育溶液pH值相同的磷酸缓冲液进行洗涤，去除上清液，得到纳米复合材料与蛋白质的复合物。3.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（SDS-PAGE）向上述的纳米复合材料与蛋白质的复合物中加入同等体积的SDS-PAGE上样缓冲溶液，在沸水中煮沸后，将其加于凝胶孔道中。采用5%浓缩胶和12%的分离胶，在120V恒压条件下进行分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于新型纳米复合材料的蛋白质组样品预处理方法，其特征在于：新型纳米复合材料与蛋白质组样品在不同pH值的缓冲液中进行孵育，并采用相应缓冲液洗涤后，得到相应pH条件下材料与蛋白质的复合物。

【技术特征摘要】
1.一种基于新型纳米复合材料的蛋白质组样品预处理方法，其特征在于：新型纳米复合材料与蛋白质组样品在不同pH值的缓冲液中进行孵育，并采用相应缓冲液洗涤后，得到相应pH条件下材料与蛋白质的复合物:缓冲液pH值为3-10，所述缓冲液为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中的一种或两种以上；(1)将氧化石墨烯分散于水中，超声使其分散均匀；加入与氧化石墨烯质量比为10-1000倍的聚乙烯亚胺，室温震荡反应5min-70min后，加入与聚乙烯亚胺质量比为1/5-1/100的氯金酸，震荡均匀，30-100℃反应5-90min；双蒸水反复洗涤后，离心并分散于100μL水中；向200-500μL上述颗粒中加入25-100mg巯基-聚乙二醇溶液，水溶液体系中反应2-24h...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，邓楠，江波，陈远波，吴琪，杨开广，梁振，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21