本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种去除植物叶片Rubisco，富集和分离剩余蛋白质的电泳方法。该方法先利用18％的PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco，再通过TCA-丙酮沉淀法抽提剩余蛋白质，进行双向电泳分离西瓜叶片剩余蛋白质。与全蛋白质双向电泳图谱相比，采用18％PEG沉淀西瓜叶片Rubsico后，Rubsico的大小亚基大部分消失，剩余的蛋白点大部分表达量均上调，分离到的蛋白质增加了48.4％，在分子量小于25.0kDa的区域出现大量新的蛋白点(63±15个)，经反复实验证明，重复性好，图谱清晰，结果可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
,涉及一种去除植物叶片Rubisco酶干扰,富集和分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法，更特别的是涉及一种去除西瓜叶片Rubisco酶干扰，富集和分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法。
技术介绍
西瓜是我国重要的经济作物之一，也是世界性重要的水果型蔬菜，研究其抗逆性机理和营养品质功能因子对于西瓜的栽培和生产尤其重要。西瓜叶片蛋白质组学研究能够为西瓜的抗逆性栽培和营养品质分析提供重要的功能信息。蛋白质双向电泳是蛋白质组学研究分离蛋白质最常用的技术手段。然而，西瓜叶片中大约有50%的可溶性蛋白质为核酮糖 I，5_ 二憐酸羧化 / 加氧酶(Ribulose-1, 5-bisphosphate carbox-ylase/oxygenase, Rubisco)，导致西瓜叶片中其他低丰度蛋白质提取不完全或者遮挡和限制了低丰度蛋白质进入二维凝胶和低丰度蛋白质在凝胶上的显现，使得西瓜叶片蛋白质组学研究的质谱鉴定结果大多为Rubisco的大小亚基，妨碍了其他低丰度蛋白质的分离和鉴定，尤其是一些调控因子和信号因子很难或不能被双向电泳分离到，成为困扰西瓜叶片蛋白质组研究的难题。目前，去除叶片Rubisco酶干扰的方法主要有以下四种1)Rubisco免疫耗竭柱 (Immunodepletion columns) (Cellar et al. , 2008)和抗体亲和的方法(Hashimoto and Komatsu, 2007)。这两种方式虽然能够有效地去除植物叶片中的Rubisco酶，但均基于免疫学原理，要求抗体特异性非常强，成本较高，一般实验室无法进行。2)肌醇六磷酸沉淀法 利用肌醇六磷酸与不同浓度的Ca2+结合作为沉淀介质，在高温孵育的条件下去除叶片中的 Rubisco0该方法操作繁琐复杂，且其去除操作需在高温下进行(37°C或42°C)，可能导致其他蛋白质，尤其是一些调控因子和信号因子的降解和损失(Krishnan and Natarajan, 2009 ;李红兵和康振生，2011)。3)高浓度的二硫苏糖醇(DTT)沉淀法(Cho et al. ,2008), 其原理和有效性还有待进一步考察和验证。4)聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(PEG)是一种常用的用来沉淀蛋白质的水溶性非离子聚合物，不同浓度的PEG沉淀出来的蛋白质不同，在盐浓度和PH值一定的介质中，与蛋白质的等电点和分子量有关。采用PEG去除植物叶片中Rubisco简便有效，成本低。自Kim et al. (2001)采用不同浓度的PEG对水稻叶片全蛋白进行分馏以除去水稻叶片中Rubisco酶后，15%或16% 的PEG很快就被一些研究者广泛运用在水稻叶片低丰度蛋白质组学研究中(Lee et al.， 2007 ；Lee et al.，2010)。然而，由于采用PEG沉淀蛋白质与蛋白质的分子量和等电点有关，不同植物叶片的Rubisco酶分子量和等电点存在一定的差异(柴常星等，1985)，因此， 采用15%或者16% PEG去除水稻叶片Rubisco酶的方法并不适用于西瓜叶片上。另外,单子叶植物水稻叶片中含有大量的纤维素和木质素，各个组分和含量与西瓜叶片蛋白质组成均不相同，其所用的酚抽法或丙酮沉淀法抽提剩余蛋白质的方法也不是抽提西瓜叶片蛋白质的最佳方案。因此，本专利技术试图找到一个去除西瓜叶片Rubisco酶的最佳的PEG浓度,能够简便快速的富集剩余的低丰度蛋白质，并创建了一种适合分离西瓜叶片低丰度蛋白质双向电泳的方法，对于西瓜的抗逆性研究和品质育种有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种去除西瓜叶片Rubisco的方法。本专利技术的另一目的是提供一种去除西瓜叶片Rubisco干扰，分离剩余蛋白质的双向电泳方法。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现一种去除西瓜叶片Rubisco的方法利用18% (g/100ml,下同)的PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco。该方法具体为采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为O. Olmm 0.05mm粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比I : 3加入预冷匀浆缓冲液后混匀， 将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4°C下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清，4°C下于l，5000g，离心20分钟，弃沉淀，保留上清；在上清液中加入18%的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4°C下于l，5000g，离心25分钟，弃沉淀，保留上清。一种去除西瓜叶片Rubisco干扰，分离剩余蛋白质的方法，先利用18 %的 PEG-4000沉淀西瓜叶片中的Rubisco，再通过双向电泳分离西瓜叶片剩余蛋白质。 该方法优选包括如下步骤A)采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为O. Olmm O. 05mm 粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比I : 3加入预冷匀浆缓冲液后混匀，将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4°C下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清，4°C下于1,5000g,离心20分钟,弃沉淀,保留上清；B)在上清液中加入18 %的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4°C下于 l，5000g,离心25分钟,弃沉淀,保留上清；C)在提取的上清中加入10% (v/v)三氯乙酸-丙酮溶液，于-20°C放置过夜，所述的入10% (v/v)三氯乙酸-丙酮溶液中含有O. 07%的β-巯基乙醇；D)取出离心管，4°C下于2，5000g，离心25分钟，弃上清，保留沉淀，加入含O. 07% 的巯基乙醇的丙酮清洗沉淀，于_20°C放置I小时。重复上述洗涤离心操作4次至离心管中蛋白质沉淀发白，无杂色，弃上清，保留沉淀；E)将留有沉淀的离心管置于通风橱中，室温下干燥20-30分钟，得蛋白粉末；F)在含有蛋白粉末的离心管中加入裂解液，室温下放置40-60分钟；G)4°C下于3，000(^，离心30分钟，弃沉淀，保留上清，置于-801保存备用；H)对步骤G所得上清先进行等电聚焦电泳，再进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳；步骤A中所述的匀浆缓冲液为PH 8. 3,0. 5M的Tris-HCl，含2% (v/v)的NP-40， 20mMMgCl2,2% (v/v)的 β-巯基乙醇和 I % (v/v)的 PMSF ;步骤F中所述的裂解液含8M尿素，IM硫脲，2%的CHAPS，65mM DTT, O. 08 % IPG buffer(PH4-7)。所述等电聚焦电泳中，蛋白质上样量为800ug/18cm胶条，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中采用的染色方法为常规考马斯亮蓝R-250方法。有益效果本专利技术通过采用不同浓度的PEG-4000去除西瓜叶片Rubisco，发现18% PEG是去除西瓜叶片Rubisco的最佳浓度,一方面,能够最大限度地去除西瓜叶片Rubsico ;另一方面，剩余的蛋白质得到了明显的富集，尤其是低分子量(分子量约为23. 4kDa)的蛋白质在 I-DE和2-DE图谱上均达到了显现和分离的效果。采用18% PEG去除西瓜叶片的Rubisco 后，剩余蛋白质的2-DE图谱上，Rubsico的大小亚基大部分消失,剩余的蛋白点大部分表达量均上调，分离到的蛋白质增加了 48.4本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭世荣，阳燕娟，孙锦，严蓓，何立中，李斌，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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