超载和洗脱层析制造技术

本发明专利技术提供了通过超载层析材料和洗脱产物，从包含多肽和至少一种污染物的组合物中纯化多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】超载和洗脱层析相关申请本申请要求于2011年11月2日提交的临时专利申请U.S.系列号61/554,898的优先权益，其通过引用全文整合到本文中。专利
本专利技术提供了从包含产物和至少一种污染物的组合物中纯化产物的方法，和包含通过所述方法纯化的产物的制剂。专利技术背景阴离子交换(AEX)层析被普遍用于流通模式中作为单克隆抗体(MAb)的平台精制步骤。在标准的流通条件下结合AEX树脂的某些Mab可以解决设备的适应性难题。对于质量要求通常较低的早期临床研发阶段，通过使用结合和洗脱模式的AEX或混合模式的树脂纯化这些非平台性的Mab。然而，由于这些树脂的低动态结合容量(DBC)，晚期执行时将需要大小约1000L的柱子，或者在较小柱子上进行多次循环，因而限制了设备的通量。通常使用结合和洗脱层析(B/E)或流通(F/T)层析实施MAb纯化。目前，已经将弱分配层析(Kelley,BD等，2008BiotechnolBioeng101(3):553-566；美国专利申请公开号2007/0060741)和过载层析(PCT/US2011/037977)分别导入到AEX树脂和阳离子交换(CEX)树脂上，以增强MAb纯化。下文强调了这些层析模式每者的一般机制和限制。结合和洗脱层析：在B/E层析中，通常装载产物使层析材料的DBC最大化，然后鉴别洗涤和洗脱条件，使得洗脱液中获得最大产物纯度。B/E层析的限制是装载密度与实际树脂DBC的限制。流通层析：使用F/T层析，鉴别了这样的装载条件，在所述条件下杂质与层析材料强结合，同时产物流通。F/T层析允许对标准MAb进行高装载密度，但对非平台性MAb却不能执行，或者能够对那些非平台性MAb进行F/T操作的溶液条件不能在现有的生产设备中执行。弱分配层析：该操作模式通过鉴别溶液条件，增强了F/T模式，在所述溶液条件下具有MAb与树脂的弱结合(2至20g/L)。在这些条件下，杂质比在F/T模式下的结合更强，因而获得了增强的纯化。然而，装载条件靶向具有范围在0.1-20内的低产物分配系数(Kp)。过载层析：在该层析模式下，超过层析材料对产物的动态结合容量装载目标产物，因而被称为过载。所述操作模式已被证实用阳离子交换(CEX)基质，特别是用膜提供了MAb纯化。然而，该方法的限制是树脂的低产量，因为没有洗脱阶段。将多肽大规模的、有成本效益地纯化至足以用作人治疗剂的纯度仍然是艰巨的难题。本文引用的所有参考文献，包括专利申请和公开都通过引用全文整合到本文中。概述本专利技术提供了用于从包含多肽和一种或多种污染物的组合物中纯化多肽的方法，所述方法包括a)以超过层析材料对于多肽的动态结合容量的量将组合物装载到层析材料上，b)在其中一种或多种污染物仍然与层析材料结合的条件下，从层析材料上洗脱多肽，和c)混合包含步骤a)和b)的层析流出液中的多肽的级分。在一些实施方案中，多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体；例如但不限于嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗体是抗原结合片段；例如但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、di-scFv、bi-scFv、串联(di,tri)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗体、BiTE、双抗体和三价抗体。在一些实施方案中，多肽是酶、激素、融合蛋白、含有Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子或白介素。在一些实施方案中，多肽是从包含一种或多种污染物的组合物中纯化的；例如，中华仓鼠卵巢蛋白(CHOP)、宿主细胞蛋白(HCP)、泄露的蛋白A、羧肽酶B、核酸、DNA、产物变体、聚集的蛋白质、细胞培养基组分、庆大霉素、多肽片段、内毒素和病毒性污染物。在本专利技术的一些实施方案中，层析材料选自混合模式材料、阴离子交换材料、疏水性相互作用材料，和亲和材料。在一些实施方案中，以约层析材料对于一种或多种污染物的动态结合容量将组合物装载到层析材料上。在一些实施方案中，多肽的层析材料的分配系数大于30或大于100。在一些实施方案中，方法提供了这样的OEC，其中洗脱缓冲液具有小于装载缓冲液的电导率的电导率。在其他实施方案中，洗脱缓冲液具有大于装载缓冲液的电导率的电导率。在一些实施方案中，方法提供了这样的OEC，其中洗脱缓冲液具有小于装载缓冲液的pH的pH。在其他实施方案中，洗脱缓冲液具有大于装载缓冲液的pH的pH。在一些实施方案中，方法的多肽在来自亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、混合模式层析和疏水性相互作用层析的洗出液中。在一些实施方案中，多肽在来自蛋白A层析的洗出液中。在一些实施方案中，还通过例如病毒过滤、亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、混合模式层析和/或疏水性相互作用层析进一步纯化方法的多肽。在一些实施方案中，多肽是通过例如超滤、渗滤或超滤和渗滤的组合而进一步浓缩的。在一些实施方案中，方法的多肽还与可药用的运载体组合。附图简述图1显示了在MAb3的分批结合条件下，在CaptoAdhere树脂上的高通量筛选(HTS)结果。图1A显示了MAb3的Kp常数值的等值线。图1B显示了在用树脂尝试80g/L产物的上清液时，MAb3的实际结合容量。图1C显示了在用树脂尝试80g/L产物的上清液时，杂质(宿主细胞蛋白)的实际结合容量。所有的等值线图都是使用源自原始数据的应答表面模型生成的。图2显示了优化的OEC操作模式的层析图。用于该次运行的MAb3的装载密度为180g/L。图3显示了使用MAb3的OEC模式的装载优化。图4显示了具有OEC操作模式的靶装载条件的层析图。相似的装载和洗脱条件导致拖尾，因而导致混合物体积增加了45％。用于该次运行的MAb3的装载密度为180g/L。图5显示了使用MAb3的OEC模式的洗脱优化。图6显示了级分中的杂质分析和杂质的累积分析。图7显示了在1000g/L装载密度的OEC模式下，CaptoAdhere树脂的MAb3CHOP贯穿(breakthrough)分析。图8显示了在从70g/L至180g/L的装载密度范围内试验性规模运行的产率分析。图9显示了对弱分配层析操作模式和过载和洗脱层析操作模式的比较。产物是MAb3，层析材料是CaptoAdhere树脂。图10显示了在150g/L装载密度的OEC操作模式下，QMA树脂的MAb3CHOP分析。图11显示了在150g/L装载密度的OEC操作模式下，CaptoAdhere树脂的MAb4CHOP分析。图12显示了在150g/L装载密度的OEC操作模式下，CaptoMMC树脂的MAb4CHOP分析。图13显示了在200g/L装载密度的OEC模式下，CaptoAdhere树脂的MAb3CHOP贯穿分析。将MAb3蛋白A混合物装载到CaptoAdhere树脂上，至200g/L(超过产物结合容量50g/L)。CHOP贯穿分析显示多至200g/LMAb处理CHOP未贯穿。专利技术详述I.定义如本文描述的术语“产物”是待通过OEC纯化的物质；例如，多肽。术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换的使用，指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，可以包含经修饰的氨基酸，并可以被非氨基酸中断。术语还涵盖了被天然地或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，形成二硫键、糖基化、脂化、乙酰本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于从包含多肽和一种或多种污染物的组合物中纯化多肽的方法，所述方法包括a)以超过层析材料对于多肽的动态结合容量的量将组合物装载到层析材料上，b)在一种或多种污染物仍然与层析材料结合的条件下，从层析材料上洗脱多肽，和c)混合包含步骤a)和b)的层析流出液中的多肽的级分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.02 US 61/554,8981.用于从包含抗体和一种或多种污染物的组合物中纯化抗体的方法，所述方法包括a)以超过层析材料对于抗体的动态结合容量的量将组合物装载到层析材料上，b)在一种或多种污染物仍然与层析材料结合的条件下，从层析材料上洗脱抗体，和c)混合包含步骤a)和b)的层析流出液中的抗体的级分，其中组合物的装载密度在200g/L至1000g/L之间并且其中方法还包括使用装载缓冲液和洗脱缓冲液，其中洗脱缓冲液具有小于装载缓冲液的电导率的电导率。2.权利要求1的方法，其中抗体是单克隆抗体。3.权利要求2的方法，其中单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体，或人抗体。4.权利要求2的方法，其中单克隆抗体是IgG单克隆抗体。5.权利要求1的方法，其中抗体是抗原结合片段。6.权利要求5的方法，其中抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、di-scFv、bi-scFv、串联(di,tri)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗体、BiTE、双抗体或三价抗体。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中至少一种污染物是中华仓鼠卵巢蛋白(CHOP)、宿主细胞蛋白(HCP)、泄露的蛋白A、羧肽酶B、核酸、DNA、产物变体、聚集的蛋白质、细胞培养基组分、庆大霉素、多肽片段、内毒素和病毒性污染物中的任何一种或多种。8.权利要求1-6中任一项的方法，其中层析材料是混合模式材料、阴离子交换材料、疏水性相互作用材料，或亲和材料。9.权利要求1-6中任一项的方法，其中以层析材料对于一种或多种污染物的动态结合容量将组合物装载到层析材料上。10.权利要求1-6中任一项的方法，其中以层析材料对于抗体的动态结合容量的20倍将组合物装载到层析材料上。11.权利要求1-6中任一项的方法，其中层析材料对抗体的分配系数大于30。12.权利要求11的方法，其中层析材料对抗体的分配系数大于100。13.权利要求1的方法，其中装载缓冲液具有4.0mS/cm至7...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·纳达拉贾，A·梅塔，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH