本发明专利技术属生物制药领域，涉及一种与人分子佐剂ｈＣ３ｄ３交联的避孕疫苗，即ｈＣＧβ－ｈＣ３ｄ３融合蛋白避孕疫苗。本发明专利技术选用真核表达载体ｐＣＩ，构建带有纯化标签的ｈＣＧβ－ｈＣ３ｄ３融合蛋白和ｈＣＧβ蛋白的真核表达质粒，通过动物宿主获得高效表达，经鉴定、纯化得高纯度目的蛋白，通过体外刺激人ＰＢＭＣ实验，证实人分子佐剂ｈＣ３ｄ３增强ｈＣＧβ蛋白疫苗体液免疫效力和抗生育潜能。较现有技术，其抗生育效果及其作用机理将更为合理、安全。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物制药领域，涉及一种与人分子佐剂hC3d3交联的避孕疫苗，即hCG e-hC3d3融合蛋白避孕疫苗。
技术介绍
人絨毛膜促性腺激素(hCG)是由胎盘合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素，其 主要的生理功能是延长黄体寿命，使之增大成为妊娠黄体，增加甾体激素的分泌以 维持妊娠。hCG是妊娠期暂时出现的一种特异性激素，己有研究证实，中和hCG的生 物学活性可以在不干扰其它生殖生物学功能的情况下中止妊娠，因此hCG成为避孕疫苗设计中最理想的靶抗原。基于hCG结构中e亚基的特异性，以hcce为基础的合成 肽疫苗已经进入了n期临床实验。实验结果显示，hCGe避孕疫苗具有可喜的应用前景，但免疫效果个体之间的差异性和目前仅有的80%的避孕效果距临床应用相距甚远。因此，如何显著增强其具有抗生育作用的体液免疫效应，减弱有可能导致生殖系自身免疫损伤的细胞免疫效应已成为hCGe避孕疫苗的研究目标。为了打破机体对 hCGe这个小分子自身抗原的免疫耐受，以往研究中大多采用白喉类毒素(DT)或破 伤风类毒素(TT)作为载体增强其免疫原性，但DT和TT却存在着载体介导的表位抑制 效应。在哺乳动物免疫系统中，C3d是补体C3的最后裂解产物之一，它与B细胞和滤泡树 突状细胞(FDC)上的受体(CR2， CD21)的相互作用对于正常体液免疫应答的诱导和维 持至关重要。1996年Dempsy首次报道C3d是一个能显著增强体液免疫效力的分子佐 剂，将C3d与抗原融合形成的C3d-抗原复合物能使抗原的免疫原性增强1000 10000 倍。此后，许多研究证实C3d是一个具有巨大潜能的疫苗佐剂。Thomas D. Greeri等报道把膜结合形式的三个拷贝C3d (mC3d3)与流感病毒血凝素(HA)相联形成的mHA-C3d3 DNA疫苗和Mitchell JA等把分泌形式的三个拷贝C3d(sC3d3)与麻疹病毒血凝素(H) 相联形成的sH-C3d3 DNA疫苗在保护性免疫的出现、抗体亲和力的成熟和中和滴度方 面都明显强于HA和H。最近他们采用了相似的方法把I型人类免疫缺陷病毒包膜表面 蛋白(HIV-lgpl20)融合到了C3d3的羧基端，并在啮齿类动物中再次验证了C3d3增 强体液免疫效应的能力。对于hCGe避孕疫苗而言，决定其避孕效果的是体液免疫效 力，而非细胞免疫。细胞免疫不仅没有中和hCG0生物学活性的能力，在一定程度上 还存在着导致生殖系耙细胞自身免疫损伤的危险。因此，用基因工程技术研制hCG e避孕疫苗，并显著增强其具有抗生育作用的Th2型及体液免疫效应，减弱Thl型及 CTL效应是hCG P避孕疫苗的研究目标。以往的研究,利用基因工程技术构建了hCGe与3个拷贝C3d分子的真核表达质粒 pcDNA3- hCGP-C3d3，所得到的融合蛋白经鉴定证实既具有CD21分子结合活性，也 具有hCGe抗原性。在以上研究基础上，将hCGP-C3d3cDNA构建入表达效率更高的真 核载体pCMV4，通过对BALB/c小鼠的基因免疫，显示分子佐剂C3d3使hCGe的免疫原性 增强了200多倍，并实现了免疫效应从Thl型细胞免疫向Th2型体液免疫偏倚。由于基 因疫苗在宿主细胞中的表达限制和基因疫苗在与宿主细胞基因组整合过程中，有可 能激活原癌基因或破坏抑癌基因，理论上存在着致癌的危险性。因此，体外表达、 纯化hCGP-C3d3融合蛋白，制备基因工程疫苗，并针对此融合蛋白研究hCGe-C3d3 疫苗的免疫效应、抗生育效果及其作用机理将更为合理、安全。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效、稳定、廉价的与人分子佐剂C3d3交联的hCGP -hC3d3融合蛋白避孕疫苗。本专利技术的另一 目的是提供一种制备hCG e -hC3d3融合蛋白的方法。本专利技术避孕疫苗含有与人分子佐剂C3d3交联的hCG f3 -hC3d3融合蛋白，通过下述 方法制备选用真核表达载体pCI，构建带有纯化标签的hCGP-hC3d3融合蛋白和hCGp蛋白的真核表达质粒，即pCI-6His-hCGP—hC3d3，通过在中国仓鼠卵巢(CH0) 系统中获得高效表达，经鉴定、纯化得高纯度目的蛋白融合蛋白hCGB-hC3d3。本专利技术制备所述的避孕疫苗包括下述步骤-1. hC3d基因克隆及构建重组pCI-gs-signal-6His-hCGP 、 pCI-gs - signal-6His -hCGP -hC3d3真核表达质粒;2. 目的蛋白表达,鉴定、纯化；3. hCGP-C3d3促进B细胞表达CD86及CD80分子；4. hCG0-C3d3促进共培养的PBMC、 B+T细胞CD86、 CD80、 CD154、 CD25分子表达;5. hCGp-C3d3促进共培养的PBMC、 B+T细胞分泌IL-2 ;本专利技术选用真核表达载体pCI，分别构建带有6个组氨酸(6His)纯化标签的hCG e-hC3d3融合蛋白和hCGP蛋白的真核表达质粒，即pCI-6His-hCGe—hC3d3。本发 明克隆了人源C3d (hC3d)，构建了真核表达质粒；实现了在中国仓鼠卵巢(CH0) 系统中获得融合蛋白hCG P -hC3d3高效表达。经鉴定、纯化得到较高纯度的目的蛋白。 通过体外剌激人PBMC，证实人分子佐剂hC3d3增强hCGe蛋白疫苗体液免疫效力和抗 生育潜能。较现有技术，其抗生育效果及其作用机理将更为合理、安全。附图说明图l是pCI-gs-signal-6His-hCGe 、pCI-gs-signal-6His-hCG e-hC3d3真核表达 质粒构建示意图。图2是pCI-gs-signa卜6His-hCGe 、 pCI-gs-signal-6His-hCG e-hC3d3真核表 达载体酶切鉴定图其中1: X-Hind III Marker; 2: pCI-gs-signal-6His-hCG P-hC3d3; 3: p Cl-gs-signal-6His-hCGP ; 4: pCI-gs-signal-6His-hCGP -hC3d3 /EcoR I; 5: pCI-gs-sigrml-6His-hCGP/EcoR I 图3是Western blotting分析pCI-gs-signal-6His-hCG P-hC3d3及pCI-gs-signal-6His-hCGe表达产物，其中1, 3:Biotinylated Protein Ladder; 2: There are three protein bands of 136Ka (hCGe -hC3d3)， 100 KDa (hCGP -hC3d2)， 64 KDa (hCGP -hC3d); 4: One protein band of hCGP (24 KDa)。图4是Raji细胞免疫细胞化学染色鉴定pCI-gs-signal-6His-hCG P -hC3d3及 pCI-gs-signal-6His-hCGP表达产物。图5:人外周血免疫活性细胞CD80、 CD86、 CD154、 CD25的表达,其中* P〈0. 05 and **P〈0. 01。图6: PBMC经不同浓度抗原刺激48h培养上清IL-2产量，其中* P〈0. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携人分子佐剂的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于含有与人分子佐剂Ｃ３ｄ３交联的ｈＣＧβ－ｈＣ３ｄ３融合蛋白，通过下述方法制备：选用真核表达载体ｐＣＩ，构建带有纯化标签的ｈＣＧβ－ｈＣ３ｄ３融合蛋白和ｈＣＧβ蛋白的真核表达质粒，通过动物宿主表达系统获得高效表达，经鉴定、纯化得高纯度目的蛋白，包括下述步骤：１）ｈＣ３ｄ基因克隆及构建重组ｐＣＩ－ｇｓ－ｓｉｇｎａｌ－６Ｈｉｓ－ｈＣＧβ、ｐＣＩ－ｇｓ－ｓｉｇｎａｌ－６Ｈｉｓ－ｈＣＧβ－ｈＣ３ｄ３真核表达质粒；２）表达，鉴定、纯化目的蛋白融合蛋白ｈＣＧβ－ｈＣ３ｄ３；３）ｈＣＧβ－Ｃ３ｄ３促进Ｂ细胞表达ＣＤ８６及ＣＤ８０分子；４）ｈＣＧβ－Ｃ３ｄ３促进共培养的ＰＢＭＣ、Ｂ＋Ｔ细胞ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ１５４、ＣＤ２５分子表达；５）ｈＣＧβ－Ｃ３ｄ３促进共培养的ＰＢＭＣ、Ｂ＋Ｔ细胞分泌ＩＬ－２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李大金，
申请(专利权)人：复旦大学附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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