本发明专利技术属基因工程生物技术领域，具体公开了一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的设计、制备方法及其药学应用。该肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体是由CD13的配体、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成融合蛋白质，通过基因工程方法通过克隆构建该变体的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化而生产。通过该肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体制备方法生产的变体具有很好的肿瘤组织靶向性，并且显著增强的抗肿瘤效果，能够降低获得治疗效果所需要的蛋白质给药剂量，提高其生物利用度，降低治疗成本和克服肿瘤坏死因子相关凋亡配体潜在的毒副作用。同时本发明专利技术中肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的生产方法提供一种生产可溶性、高聚体形式含量的表达方法和简便的分离纯化工艺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属基因工程生物
，涉及一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的制备及其药学应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一个成员。与肿瘤坏死因子超家族其它成员类似，可溶性形式的肿瘤坏死因子相关配体以三聚体形式与靶细胞表面三聚体化的受体分子结合而发挥生物学功能。肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导凋亡的作用是通过与肿瘤细胞上的死亡受体4 (DR4)和死亡受体5(DR5)的相互作用传递死亡信号而实现的。虽然肿瘤坏死因子超家族的其它成员由于具有全身性的毒副作用而使应用受到限制，但是肿瘤坏死因子相关凋亡配体是一个相对安全、具有肿瘤选择性的抗肿瘤 物质。肿瘤坏死因子相关凋亡配体在体外能诱导多种肿瘤细胞和癌化细胞的凋亡，并且在小鼠的移植异种肿瘤，包括结肠癌、乳腺癌、多重性骨髓瘤、神经胶质瘤、前列腺癌等多种模型中具有较好的抗肿瘤活性。尤其重要的是，在小鼠和非人类灵长类动物中全身给药时，TRAIL表现出较小或没有毒性。基于以上原因，重组肿瘤坏死因子相关凋亡配体已经在进行肿瘤治疗的临床研究。但是近来一些报道显示除了诱导肿瘤细胞的凋亡外，肿瘤坏死因子相关凋亡配体还涉及到天然免疫和获得性免疫，和自身免疫性疾病相关。例如，近来的研究报道表明它在胸腺的发育过程中调节负向选择或凋亡胸腺细胞，并且在诱发自体免疫性疾病如I型糖尿病中起重要作用。此外，肿瘤坏死因子相关凋亡配体的受体在整个身体广泛性表达，肿瘤坏死因子相关凋亡配体还参与肝细胞死亡和肝炎。因此在临床上重复、全身性使用大剂量外源性肿瘤坏死因子相关凋亡配体蛋白可能会导致不可预料的免疫结果。这些报道使科学家非常担心肿瘤坏死因子相关凋亡配体在临床中重复和持久使用时产生潜在的副作用。如何在肿瘤治疗时，避免肿瘤坏死因子相关凋亡配体对其它组织的毒副作用，这是肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)在潜在的临床应用中面临的难题。
技术实现思路
为克服野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤治疗方面所面临的缺陷，本专利技术目的在于专利技术一种具有肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体，将其靶向输送到肿瘤组织中，以此提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的疗效，降低其毒副作用，从而能在治疗肿瘤疾病中得到应用。氨基酞酶N(Aminopeptidase N, APN)/0)13蛋白是一种经研究证明只表达在肿瘤新生血管内皮细胞上的蛋白质(Pasqualini R, Koivunen E, Kain R等，CancerRes. 2000,60 :722-727)，处于静止状态的正常血管内皮细胞很少表达⑶13，近年来发现氨基酞酶N/OH3也与肿瘤的转移和预后相关联(Haraguchi N, Ishii H, Mimori K等，J Clin Invest.2010,120 :3326-3339 ；Fontijn D, DuyndamMC, van Berkel MP等，Br J Cancer. 2006,94 :1627-1636 ；Fujii H, NakajimaM, Saiki I 等，Clin ExpMetastasis. 1995,13 :337-344)。为达到实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体肿瘤组织靶向输送，提高其抗肿瘤疗效、降低其毒副作用的目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现的一种具有肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体，是具有序列表中序列I氨基酸残基序列的蛋白质，它是通过基因工程方法构建由CD13的配体、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质，即利用常规基因工程方法通过人工合成或者克隆构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化。所述CD13的配体可以是一种含有NGR序列的多肽，优选为一种带有环状结构的、含有NGR序列的多肽，例如短肽CNGRC。上述的CD13的配体和肿瘤坏死因子相关凋亡配体所构成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体之间可以添加一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽，其中，短肽为1-25个氨基酸残基，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成。 上述的⑶13的配体放置于肿瘤坏死因子相关凋亡配体N端时，在⑶13的配体之前增加一个不含支链的氨基酸，主要是丙氨酸或甘氨酸，以防表达时出现的N端氨基酸降解，影响⑶13配体的功能。所述合成的CD13的配体和肿瘤坏死因子相关凋亡配体所组成肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体在制备肿瘤治疗药物中具有良好的应用。以上述肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体制备的肿瘤治疗药物与现有化疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法在肿瘤治疗中能够得到联合运用。进一步地，一种在大肠杆菌中可溶性表达和简便分离纯化大量的、高纯度肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的聚体的方法。尽管目前肿瘤坏死因子相关凋亡配体在大肠杆菌中表达多为无生物活性的包涵体产物，而本专利技术中的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更为复杂，因此在大肠杆菌中表达时，其包涵体形成将更为严重、纯化将更为复杂。本专利技术采用了低温下培养和诱导表达肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法，使得表达产物有效避免了包涵体的形成；本专利技术同时利用了肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有鏊合金属离子的生物功能，利用离子交换层析和金属亲和层析相结合使得肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体得到了有效的纯化、获得了高纯度的蛋白质产物，而且纯化产物具有高比例的聚体形式，因此具有非常好的生物活性。其中低温指35°c -10°c。⑶13只表达在肿瘤新生血管内皮细胞上，处于静止状态的正常血管内皮细胞很少表达。最近的研究证实，⑶13蛋白受碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)调节，选择性高表达于1F6恶性黑色素瘤等肿瘤细胞表面，并且与肿瘤的恶性侵润和转移密切相关。我们用流式细胞仪分析了 CD13在不同细胞中的表达水平，结果表明人微血管内皮细胞高水平表达⑶13，人宫颈癌细胞Hela肿瘤细胞⑶13表达水平也较高，结肠癌细胞HCT-15表达中等量的⑶13分子，结肠癌细胞C0L0-205表达极微量或不表达⑶13分子。上述由⑶13配体、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体可以大大提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织中的分布、实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织中的靶向输送、大大提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的抗肿瘤效果、同时显著降低肿瘤坏死因子相关凋亡配体的用量。同时编码公开肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的cDNA，它可以通过肿瘤坏死因子相关凋亡配体的dDNA增加编码的⑶13配体和连接肽的DNA序列制备。上述组成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的cDNA可用于基因治疗。本专利技术的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体可以通过采用聚乙二醇、月旨肪酸化、重组加上抗体Fe片段或白蛋白等方法修饰，从而延长肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的半衰期，达到更好的药代动力学效果。同已有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体相比，本专利技术具有的有益效果(I)更好的肿瘤组织靶向性现有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于肿瘤组织的相对选择性作用主要是利用肿瘤组织本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体，其特征是由CD13的配体肽段、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体构建而成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，曹林，唐波，
申请(专利权)人：江苏靶标生物医药研究所有限公司，常州南京大学高新技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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