本发明专利技术公开了一种融合蛋白GPR174-Gilα及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的融合蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将(a)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列1衍生的蛋白质。单独的GPR174或Gilα蛋白脱离了生命状态(活细胞环境)是无法结合在一起的，需要借助细胞内环境，才能结合成为被Gilα蛋白特异性抗体识别的蛋白复合物。而本发明专利技术提供的融合蛋白，脱离了生命状态(活细胞环境)即具有Gilα蛋白的抗原活性，可以作为体外筛选系统，对候选的作为药物的化合物或小分子进行筛选(考察其能否与融合蛋白结合)。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种融合蛋白GPR174-Gil α及其编码基因和应用。
技术介绍
G蛋白(G-protein)是一种在细胞内信号传导途径中起着重要作用的GTP结合蛋白，由α，β，Y三个不同亚基组成。G蛋白具有GTP酶活性，有α，β，Υ三聚体G蛋白、低分子量的单体小G蛋白和高分子量的其他G蛋白三类。G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor),是一种与三聚体G蛋白偶联的 细胞表面受体，含有7个穿膜区，是迄今发现的最大的受体超家族，其成员有1000多个。G蛋白偶联受体与配体结合后通过激活所偶联的G蛋白，启动不同的信号转导通路并导致各种生物效应。G蛋白偶联受体与其配基-激素、神经递质和细胞激素等相互作用，并且充当促进或关闭一很多功能生物过程的分子开关。G蛋白偶联受体在血压调节、炎症和心理疾病等多种疾病中扮演关键角色。现代新药研究与开发的关键首先是寻找、确定和制备药物筛选靶-分子药靶。药物靶点是指药物在体内的作用结合位点，包括基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子。选择确定新颖的有效药靶是新药开发的首要任务。迄今已发现作为治疗药物靶点的总数约500个，而G-蛋白偶联的受体(GPCR)靶点占其中受体的绝大多数。高通量药物筛选是开发药物早期阶段的最重要工具之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种融合蛋白GPR174_Gil α及其编码基因和应用。本专利技术提供的蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将(a)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列I衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在(a)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列标签__残基__序歹Li_-Poly-Arg_5-6(通常为 5 个) _RRRRR 一-Poly-His_2-10(通常为 6 个)IhHHHH 一.flag~8Iykddddk —.Str印-tag II ~8~SHPQFEK — c-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得至IJ。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因具体可为如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表中序列2自5’末端I至2061位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有G蛋白抗原活性的蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有G蛋白抗原活性 的蛋白的DNA分子。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、重组细胞(转基因细胞系)或重组菌均属于本专利技术的范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于所述蛋白进行纯化，可对所用重组表达载体进行加工,如加入亲和标签等。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pFASTBacl质粒的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体还可为将所述重组质粒导入大肠杆菌DHlOBac菌株，通过菌内重组得到的含有所述基因的杆状病毒质粒。本专利技术还保护一种制备所述蛋白的方法，包括如下步骤(I)将所述杆状病毒质粒转染昆虫细胞，培养后收集上清，即为Pl代病毒液；(2)将所述Pl代病毒液感染昆虫细胞，培养后得到所述蛋白。所述步骤(I)和/或所述步骤(2)中，所述昆虫细胞具体可为sf9细胞。所述步骤(2)中，所述感染的感染剂量具体可为MOI = 5，所述培养的培养时间具体可为72h。所述步骤(I)中，所述培养的培养时间具体可为72小时。本专利技术还保护一种表达所述蛋白的试剂盒，包括大肠杆菌DHlOBac菌株、昆虫细胞和含有所述基因的重组表达载体。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pFASTBacl质粒的多克隆位点得到的重组质粒。所述昆虫细胞具体可为sf9细胞。所述蛋白可用于药物筛选。本专利技术提供的融合蛋白GPR174_Gila可以被Gil α蛋白的特异性抗体识别，说明融合蛋白具有良好的抗原活性和应有的高级结构。单独的6 町74或611(!蛋白脱离了生命状态(活细胞环境)是无法结合在一起的，需要借助细胞内环境，才能结合成为被Gil a蛋白特异性抗体识别的蛋白复合物。而本专利技术提供的融合蛋白，脱离了生命状态(活细胞环境)即具有Gil a蛋白的抗原活性，可以作为体外筛选系统，对候选的作为药物的化合物或小分子进行筛选(考察其能否与融合蛋白结合)。附图说明图I为pFASTBacl质粒的结构示意图。图2为Gila蛋白的编码基因和GPR174蛋白的编码基因的PCR扩增产物电泳图；1:DNA Marker D2000 (2000，1000，750，500，250，100) ；2 Gil α 蛋白的编码基因(约1065bp) ；5 GPR174 蛋白的编码基因(约 1002bp)。图3为融合蛋白GPR174_Gil α的编码基因的PCR扩增产物电泳图；1 DNA Marker D2000 (2000,1000,750,500,250,100) ;2 :融合蛋白 GPR174_Gil α 的编码基因。图4为在LB平板上通过蓝白斑筛选含有重组杆粒pBacmid-GPR174_Gil α的阳性克隆的照片。图5为重组杆粒pBacmid-GPR174_Gil α的PCR鉴定电泳图；I DNAMarkerD15000 (15000,10000，7500，5000，2500，1000) ；4 :重组杆粒 pBacmid-GPR174_Gil α的PCR扩增产物。图6为sf9细胞转染Pl代病毒液后的形态；1 :正常sf9细胞(阴性对照);2 :转染Pl代病毒液72h后的Sf9细胞。图7为实施例2中GPR174_Gil α融合蛋白的Western-blot检测结果。图8为不同感染剂量条件下膜总蛋白(含GPR174_Gila融合蛋白)Western-blot检测结果；1 M0I = I ；2 M0I = 2 ；3 M0I = 5 ；4 M0I = 10 ；5 :正常 sf9 细胞。图9为不同感染时间条件膜总蛋白(含GPR174_Gil α融合蛋白)Wes本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将(a)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列1衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永学，彭明丽，吴芳明，陈曦，韩春光，白月霞，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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