抗体人源化改造方法技术

本发明专利技术公开了一种人源化抗体及其人源化改造方法。该抗体是如下任一所述蛋白质：a）由序列表中序列3中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术改造后的抗体构架未改变的最初的嵌合抗体相比，与抗原的亲和力相近，并已经达到了完全的人源化，具有更好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人源化抗体及其人源化改造方法。
技术介绍
P185是由癌基因Her2/erbB_2编码的一种细胞表面的重要的受体酪氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族。P185/Her2受体与该家族其他成员类似，由胞外区，跨膜区和胞内区三个结构域组成，其中胞外区(ECD)又分为四个亚区，其中的I、III亚区为亮氨酸富含区，II、IV亚区为半胱氨酸富含区(Carpenter G. (1987) Receptors of epidermal growthfactor and other polypeptide mitogens. Annu. Rev. Biochem. 56:881-914)。表皮生长因子家族受体广泛地分布于多种组织，尤其在上皮组织、间质组织以及神经发生组织中表达，在调节细胞的増殖、分化、发育、黏附和迁移中起到了重要的作用。P185/Her2作为表皮生长 因子受体家族的信号转导网络中最重要的ー员，其表达水平的异常与细胞信号转导紊乱、肿瘤的发生和恶性发展紧密相关(Nancy EH, Heidi A, Lane N. (2005) ErbB receptors andcancer:the complexity of targeted inhioitors Nat. Rev. Cancer 5:341-354)。近年来P185/Her2 —直作为肿瘤治疗领域中的热点被广泛研究。1985年，Greene M. I.研究组发现,抗P185/Her2胞外区的单克隆抗体能够使已经转化的Her2高表达的NIH3T3表型逆转，使肿瘤细胞的表型趋于正常化，同时可以下调Her2受体的表达水平(Drebin JA, Link VC, Stern DF, Weinberg RA, Greene, MI. (1985)Down-modulationof an oncogene protein product and reversion of the transformed phenotype bymonoclonal antibodies. Cell 41:695-706)。随后该实验室又发现，抗Her2的单克隆抗体能抑制移植入裸鼠体内的Her2转化的NIH3T3肿瘤细胞的生长，从而第一次通过体内实验证明了抗Her2单抗可能对Her2高表达肿瘤有临床治疗的价值(Drebin JA, LinkVC, Weinberg RA, Greene MI. (1986) Inhibition of tumor growth by a monoclonalantibody reactive with an oncogene-encoded tumor antigen. Proc Natl Acad Sci USA83:9129-9133)。这ー发现大大促进了抗Her2单克隆抗体的抗肿瘤作用的研究，也掲示了抗体在肿瘤治疗上应用的前景。但是，由于目前杂交瘤技术制备的单克隆抗体都是鼠源抗体，应用于人体时会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，所以不能直接用于人体内的疾病治疗。因此必须对单克隆抗体进行人源化改造，以减少和消除鼠源蛋白的免疫原性。最早用于单克隆抗体人源化改造的方法是构建嵌合抗体(Vaughan TJ, OsbournJK, Tempest PR. (1998)Human antibodies by design. Nat. Biotechnol 6:535-539)。该方法是将鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区通过基因工程技术连接起来，即将鼠源抗体的恒定区基因替换为人抗体恒定区基因，与抗原结合的可变区部分仍然是鼠源抗体。此方法构建出的工程化嵌合抗体最大限度的保留了识别靶抗原能力的鼠源抗体可变区，同时又拥有了人抗体所有的恒定区的免疫学杀伤效应，而且由于这种嵌合抗体的免疫原性相比原始的鼠源抗体降低了 2/3，所以可以应用于人体治疗(Davis TA. (1999) Final reporton the saiety and elficacy of retreatment with rituximab lor patients withnon-Hodgkin’s lymphoma. Blood 94:88a)。但由于其分子中还保留了 1/3的鼠源部分,用于长期临床治疗还有可能发生人抗鼠抗体反应。因此，为了进ー步降低嵌合抗体的免疫原性，需要对嵌合抗体的鼠源可变区进行进ー步的人源化改造，获得全人源化抗体。目前应用较多的全人源化方法是将鼠源抗体可变区内參与抗原结合的部分与选择用于做模板的人抗体可变区的框架区重新拼接，使抗体可变区中除高度可变的互补决定区(CDR)来源于鼠抗体外，其余部分都换成人源的。由于抗体可变区中參与抗原结合的一般是其6个互补决定区(CDR)，故此过程也被称为“CDR移植”，然后为了克服由于“CDR移植”可能导致的亲和カ下降，需通过一系列对框架区残基的突变，逐步恢复或提高抗体的抗原结合能力，从而得到人源化程度更高的重构抗体(JonesPT,Dear PH, Foote J. u986)Replacing the complementarity-determining regions ina human antibody with those from a mouse,Riechmann L, Clark M, Waldmann H. (1988)Reshaping human antibodies for therapy, Chothia C, Lesk AM, Tramontano. (1989)AConformations of immunoglobulin hypervariable regions)。已手艮道的构建重构抗体的方法依照其人源化改造使用的模板的选择和回复抗体结合能力的方法，主要又可以分成两种。其一，通过序列対比，以序列相似性为标准分别选择相似性最高的抗体轻链和重链可变 区的人源抗体为模板序列，在经过CDR移植后的轻、重链序列基础上，针对可能影响结合能力的框架残基分别构建一系列突变体，鉴别合适的突变组合。这些突变体需各自独立制备及测试其抗原结合能力，然后将较好的突变组合起来，即需要对各个可能的残基的突变、筛选的重复循环实验，所以步骤繁复，效率低，效果不理想。其ニ，也是目前抗体人源化的ー种通用方法。具体的做法是，将非人源(例如鼠源)抗体的CDR移植于通用的人源抗体可变区模板VL K I -VH III的构架上，通过对ー组选定的关键框架区残基进行随机诱变，构建抗体Fab的噬菌体文库，再通过噬菌体亲和カ筛选鉴别出最佳框架序列。此方法相比第一种可以更快速地获得优化的框架序列，并可在此基础上进ー步提高抗体的抗原亲和カ；但是由于其选用的是通用模板，虽有普适性，但对不同抗体来讲可能不是最优的，另外通过构建噬菌体库筛选高亲和カ抗体的方法也比较复杂，费时费力。
技术实现思路
本专利技术的ー个目的是提供ー种蛋白及其编码基因。本专利技术所提供的蛋白，是如下任一所述蛋白质a)由序列表中序列3中自N末端起第1_253位氨基酸序列组成的蛋白质；(Hl_2 Vl+Linker+Vh)b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(Hl本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗体的人源化改造的方法，包括如下步骤：（1）、按照如下Ⅰ或Ⅱ所述方法选择得到人源化抗体模板：Ⅰ、选择重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板；从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人源化抗体作为人源化抗体模板；Ⅱ、选择满足如下ⅰ）和ⅱ）所示条件的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板；ⅰ）重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；ⅱ）重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区分别与待改造抗体的重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人源化抗体作为人源化抗体模板；所述可变区空间结构为如下a）和/或b）所示：a）重链可变区和轻链可变区一起构成的空间结构；b）重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的空间结构；（2）、按照如下Ⅲ或Ⅳ所示方法获得被置换后的人源化抗体模板：Ⅲ、用所述待改造抗体的重链可变区和轻链可变区中的至少一个CDR氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应的CDR氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板；Ⅳ、用所述待改造抗体的抗原结合区氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应的抗原结合区氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板；（3）、将所述步骤（2）中的被置换后的人源化抗体模板作为改造后的目的人源化抗体；（4）用基因工程方法表达得到所述改造后的目的人源化抗体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖卫华，刘兢，胡思怡，常亮，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：