一种催化丙氨酸脱羧的蛋白质及其基因和应用制造技术

一种催化丙氨酸脱羧的蛋白质及其基因和应用，属于生物基因工程技术领域。该蛋白质的氨基酸序列为：1）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列；或 2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术在茶树中发现丙氨酸脱羧酶蛋白CsAlaDC，将该蛋白对应的基因在大肠杆菌中过表达，纯化的重组蛋白同时具有催化丙氨酸脱羧的活性，验证了该基因具有催化丙氨酸脱羧的功能。

Protein for catalyzing alanine decarboxylation and its gene and Application

The invention discloses a protein for catalyzing alanine decarboxylation, a gene and an application thereof, belonging to the technical field of biological gene engineering. The amino acid sequence of the protein: 1) amino acid sequence of SEQ ID No.2 shown in; or 2) amino acid sequence of SEQ ID No.2 shown by the equivalent amino acid sequence substitution, deletion and / or addition of one or several amino acid residues formed. The experiment found that the invention of alanine decarboxylase protein CsAlaDC in tea, the protein corresponding gene overexpressed in E.coli, recombinant protein purification and catalytic activity of alanine decarboxylation, the gene has a catalytic decarboxylation of alanine to validate the function.

【技术实现步骤摘要】
一种催化丙氨酸脱羧的蛋白质及其基因和应用
本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及一种催化丙氨酸脱羧的蛋白质及其基因和应用。
技术介绍
茶氨酸（L-Theanine）是茶叶中特有的游离氨基酸，茶氨酸是谷氨酸γ-乙基酰胺，有甜味。茶叶中含有大量的茶氨酸,是形成茶叶风味的主要成分。茶氨酸含量通常占茶叶中其他氨基酸总量的50%以上。研究发现茶氨酸合成受到前提物质乙胺的调控。在植物组织培养合成茶氨酸的研究中，有学者已经证实向培养基中添加前体物质-盐酸乙胺时，可以大幅度提高愈伤组织中的茶氨酸合成量，而直接添加丙氨酸，则对茶氨酸累积影响不大。茶氨酸合成中的乙胺系由丙氨酸脱羧（CsAlaDC）而来，催化该反应即为丙氨酸脱羧酶。该酶在子叶和根中活性高，在绿色幼苗根中活性高于黄化幼苗，预示着它积极参与茶氨酸合成中所需乙胺的形成。目前，有关CsAlaDC基因的克隆鉴定未见任何报道。鉴于乙胺的添加可以极大提高茶树愈伤组织和悬浮细胞合成茶氨酸，因此CsAlaDC基因的发现对于研究茶树氮吸收与转运机制具有重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种茶树特有丙氨酸脱羧蛋白CsAlaDC及其编码基因和应用的技术方案。所述的一种催化丙氨酸脱羧的蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列为：1）SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2）SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。所述编码所述蛋白质的基因,其特征在于该基因的核苷酸序列为：1）SEQIDNo.1所示的核苷酸；或2）SEQIDNo.1所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码CsAlaDC的核苷酸序列。所述编码基因的重组载体。所述的编码基因在催化丙氨酸脱羧形成乙胺中的应用。所述的编码基因在调控茶树茶氨酸合成中的应用。所述的一种催化丙氨酸脱羧形成乙胺的方法，其特征在于包括如下步骤：将编码基因导入大肠杆菌中，诱导表达得到重组蛋白，将重组蛋白纯化后与丙氨酸溶液混合进行催化得到乙胺，所述的编码基因的核苷酸序列为：1）SEQIDNo.1所示的核苷酸；或2）SEQIDNo.1所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码CsAlaDC的核苷酸序列。所述的一种催化丙氨酸脱羧形成乙胺的方法，其特征在于丙氨酸脱羧酶的催化反应的条件为10mM丙氨酸,100mM的磷酸钾缓冲液，0.08-0.12mM磷酸吡哆醛，5mM二硫苏糖醇，1mMK2EDTA，10%的甘油，反应溶液pH为：pH7.2-pH7.8反应温度为35℃-45℃。本专利技术的实验证明，本专利技术在茶树中发现丙氨酸脱羧酶蛋白CsAlaDC，将该蛋白对应的基因在大肠杆菌中过表达，纯化的重组蛋白同时具有催化丙氨酸脱羧的活性，验证了该基因具有催化丙氨酸脱羧的功能。附图说明图1丙氨酸脱酸酶催化反应图示；图2茶树CsAlaDC的基因序列；图3不同组织CsAlaDC基因qPCR相对定量结果；图4CsAlaDC蛋白原核纯化的SDS-PAGE；图5重组CsAlaDC蛋白催化丙氨酸脱羧形成乙胺的高效液相（HPLC）检测图谱；图6催化反应2h与24h后，反应液中生成乙胺的浓度。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例（1）基因克隆：以龙井43的幼根为材料，用试剂盒法提取总RNA；根据CsAlaDC的mRNA序列设计引物，用反转录PCR法获得该基因的全长，并测序验证。反转录基因克隆所采用的引物为SDC-RT-F1:5′-CTCCTCGGATTCTCAAACCTCAC-3′；SDC-RT-R:5′-CACACAAACGATAGTAGAACCAACA-3′。（2）实时荧光定量分析：荧光定量PCR采用ABI7500实时PCR系统（AppliedBiosystems），以SYBRGreen染料进行标记。内参基因选择茶树GAPDH基因(GE651107)。采用的引物为SDC-QRT-F:5′-GGGAAGAACGTGCACACAAC-3′；SDC-QRT-R:5′-CTAACCAAGACACCGGCCAT-3′；GAPDH-F:5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′及GAPDH-R:5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′。反应体系为25ml，包含0.5mLLATaq,5mLPCR缓冲液,2mLdNTP(2.5mM),0.5mL引物(10M),1mLcDNA(40ng)和15.5mLddH2O。反应条件为:94℃，3分钟；95℃，30秒；59℃，30秒；72℃,1分钟；30个循环。72℃,10分钟；4℃保存。每组样品3个重复。如图3所示，三个茶树品种中根、成熟叶片、一芽二叶等不同组织部位CsAlaDC基因qPCR相对定量结果，说明茶树CsAlaDC基因在茶树根中特异表达。茶树CsAlaDC的基因序列如图2所示。茶树CsAlaDC的基因序列如SEQIDNo.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。（3）转基因蛋白重组表达纯化：将茶树CsAlaDC全长cDNA的编码框克隆到含有T7启动子的原核表达载体pET28b上。具体步骤包括：设计特异引物：正向引物5’-CGGGATCC(BamHI)ATGGAAGGGACTGTGTCAGTGCTATCandreverseprimer5’-CCCAAGCTT(HindIII)GTTTATGAAGATCACAATCACAATTCTCAC；表达载体构建：PCR扩增的CsAlaDC基因经酚、酚/氯仿（1:1）、氯仿/异戊醇（24:1）抽提纯化后，用BamHI和HindIII双酶切，低熔点胶电泳分离回收1500bp左右的片断。再将回收片段与经相同双酶切的表达载体pET-28b连接，从而将CsAlaDC基因定向克隆到表达载体pET-28b中，并将含有插入片断的重组质粒命名为pET-AlaDC，将重组质粒pET-AlaDC转化到E.coliBL21中，构建工程菌；IPTG诱导大肠表达及蛋白纯化：挑取经DNA测序验证的工程菌的单菌落，接入5ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养基，37℃振荡培养过夜，取50μl接入5ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养基，37℃振荡培养2h左右，加入IPTG至终浓度0.05mmol/L，于16-22℃诱导表达12-18h，室温5000r/min离心5min收集菌体。菌体破碎后，用镍柱亲和层析纯化重组蛋白，洗脱液为160mM咪唑，透析液为25mMTris-HCl（pH7.4），150mMNaCl，10%甘油。如图4所示，CsAlaDC蛋白原核纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）图。（4）丙氨酸脱羧活性验证将10μL纯酶液加到90μL反应缓冲液A中（10mM丙氨酸,100mMpH7.2-pH7.8的磷酸钾缓冲液，0.08-0.12mM磷酸吡哆醛，5mM二硫苏糖醇，1mMK2EDTA，10%的甘油），混匀后，于35℃-45℃水浴2h和24h，分别取45μL反应液于新的离心管中，加5μL10%的三氯乙酸停止反应，静置5min后，加入400μL超纯水稀释，按照WatersAccQTag氨基酸分析包中的方法进行衍生，高效液相色谱仪检测产物含量。其中丙氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种催化丙氨酸脱羧的蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列为：1）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列 ；或2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种催化丙氨酸脱羧的蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列为：1）SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2）SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因,其特征在于该基因的核苷酸序列为：1）SEQIDNo.1所示的核苷酸；或2）SEQIDNo.1所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码CsAlaDC的核苷酸序列。3.含有如权利要求2所述编码基因的重组载体。4.如权利要求2所述的编码基因在催化丙氨酸脱羧形成乙胺中的应用。5.如权利要求2所述的编码基因在调控茶树茶氨酸合成中的应用。6.一种催...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽鸳，成浩，白培贤，韦康，阮丽，张成才，李海琳，
申请(专利权)人：中国农业科学院茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33