一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法技术

本发明专利技术涉及一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法，属于药物分析技术领域。本发明专利技术将制备好的包裹有蛋白或多肽的脂质囊泡溶液稀释，取稀释后的脂质囊泡溶液加入非离子表面活性剂进行破乳，再取破乳前后的脂质囊泡溶液，分别加入BCA反应液，在一定温度和时间下显色；并在562nm处读取吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度和包封率。该方法利用脂质囊泡外游离蛋白和脂质囊泡内包裹蛋白与显色剂反应速率的差异，测量脂质囊泡蛋白药物包封率，无需对游离蛋白进行分离，操作方便，重复性好，解决了常规方法在测量脂质囊泡蛋白药物包封率时的繁琐和偏差问题，为需要脂质囊泡蛋白药物的相关生产应用和研究领域提供了一项有效的方法依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法，属于药物分析

技术介绍
多肽、蛋白类药物脂质囊泡的研究是当前一个十分活跃的领域。脂质囊泡是由脂质组成、内部为水相的闭合囊泡，其内水相和膜内分别可包裹亲水和疏水性物质。根据组成的不同，脂质囊泡有脂质体、传递体、类质体、醇质体等种类，但其结构均为球形闭合囊泡。蛋白口服后会受到胃肠道酸、碱条件，体液及酶的破坏而发生降解和失活。而以脂质囊泡为载体口服后由于脂质双层的保护作用，可降低各种因素对蛋白类药物的降解程度，提高药物的稳定性；同时口服脂质囊泡还具有种类多样，选择性和辅佐性强，不良反应低的特点，尤其作为黏膜免疫抗原载体而倍受青睐。目前包封率是脂质囊泡质量评价中的重要指标之一。目前报道的测定方法有以下几种：(1)透析法：利用半透膜分子大小差别，通过及时更换外相达到分离的目的。该方法简单、准确、重复性好，缺点是耗时较长，所耗介质较多,易造成药物渗漏。(2)超速离心法：利用自由药物与含药脂质囊泡的重力差异进行分离。但该方法成本较高，且各批样品间重现性差，由于离心力较大会使脂质囊泡中药物渗漏丢失而导致药物的包封率偏低。(3)凝胶柱色谱法：常用的色谱柱为葡聚糖凝胶(Sephadex)柱和琼脂糖凝胶(Sepharose)柱，利用脂质囊泡和游离药物相对分子质量的差异进行分离，但存在洗脱时间长、洗脱体积大、药物浓度低等问题。(4)超滤膜过滤法：利用游离药物能通过滤膜，而含药脂质囊泡被截留在滤膜上来分离游离药物与脂质囊泡。该方法的缺点是膜上药物体积小，膜对药物的吸附较强，导致包封率偏高。上述各种脂质囊泡药物包封率测定法存在一个共同的问题，即所得包封率均存在一定的误差。如透析法、层析法及滤膜法，都是利用分子大小差异进行分离，故较难将脂质囊泡与药物晶体和/或脂质囊泡碎片分离，影响包封率测定的结果；且三种方法都耗时较长，与药物浓度有很大关系，在层析柱或者滤膜的选择上也存在困难；离心法虽相对测量速度较快，但易造成脂质囊泡中药物的渗漏，对仪器存在明显依赖，使用成本较高。因此，非常有必要寻找其他的测量方法，既快速简便，又能准确地反映药物的包封情况。目前实验室研究测定蛋白质含量的常用方法主要有Folin-酚试剂法(Lowry法)、考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlueG-250，CBB)染色法，二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)法等，其中Lowry法与BCA法属于化学法。Lowry法的测定原理为蛋白质与碱性硫酸铜作用形成铜-肽键络合物，后者与色氨酸和酪氨酸共同作用使酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸还原生成蓝色化合物；BCA法的测定原理为蛋白质价铜离子还原成亚铜离子，后者在碱性溶液中与BCA结合生成紫红色络合物。Bradford法属于染料结合法，即考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中呈红棕色，与蛋白质结合后转变为蓝色，颜色深浅与蛋白浓度呈正比关系。各种方法测定蛋白浓度的范围如下：Lowry法标准蛋白浓度设置范围为10～100μg/mL；BCA法标准蛋白浓度设置在20～1000μg/mL；Bradford法为31.25～2000μg/mL。每种方法都有其优点和局限性，在蛋白质样品中往往会含有一些化学试剂，会干扰蛋白浓度测定。影响Lowry法测定蛋白的主要因素有某些氨基酸、非离子表面活性剂、蔗糖、含硫化合物；影响BCA法测蛋白的主要因素有蔗糖、尿素、EDTA，影响Bradford法的主要因素有甘油、乙酸、去污剂和一些碱性缓冲系统。对于脂质囊泡蛋白药物而言，选择BCA法可以减少非离子表面活性剂对蛋白浓度检测时的干扰。据文献报道，BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS、TritonX-100、Tween-20、Tween-60、Tween-80等表面活性剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率测定方法的不足，提供一种快速简便的包封率计算方法。根据本专利技术的包封率计算方法，其特征在于，利用脂质囊泡内外蛋白或多肽与显色试剂的反应速率差异实现包封率的计算，所述方法包括以下步骤：（1）常规制备包裹有蛋白或多肽的脂质囊泡溶液；（2）将步骤（1）中的脂质囊泡溶液中的总蛋白浓度稀释到合适范围内；（3）取一定量步骤（2）中的脂质囊泡溶液，加入破乳剂，使脂质囊泡溶解；（4）将步骤（2）和步骤（3）的脂质囊泡溶液，分别按每孔20μL加至96孔板，再在每孔中加入200μL能与蛋白或多肽进行显色反应的试剂；（5）在步骤（4）96孔板的标准品孔中分别加入0.5mg/mL的牛血清白蛋白标准品，按0、1、2、4、8、12、16、20μL加样，再加入200μL能与蛋白或多肽进行显色反应的试剂；（6）将步骤（4）和（5）的96孔板在一定温度下反应一段时间，直至出现颜色变化；（7）将步骤（6）的96孔板放置于酶标仪，选择562nm处读取吸光度值。根据标准曲线计算步骤（4）各孔蛋白浓度。（8）根据公式脂质囊泡蛋白包封率=(C总-C游)/C总×100%计算包封率，式中，C总表示破乳脂质囊泡的蛋白总浓度，C游为未处理脂质囊泡所测得的蛋白浓度。其中，步骤（1）所述脂质囊泡中包裹的物质可替换为其他能与检测试剂发生相互作用的物质；所述脂质囊泡，系能够形成囊泡结构的脂质分子，其成分包括磷脂、胆固醇、表面活性剂和其他类脂分子等。步骤（2）所述脂质囊泡稀释后的总蛋白浓度范围应处于20～1000μg/mL。步骤（3）所述破乳剂为包括且不限于TritonX-100、Tween20或Tween80等非离子表面活性剂和其他类型的破乳剂；所述破乳剂终浓度为0.1%～0.5%。步骤（4）或（5）中所述能与蛋白或多肽进行显色反应的试剂为BCA反应试剂；所述BCA反应试剂由购于上海碧云天生物技术有限公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒中的按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制而成。步骤（6）中所述反应温度为37ºC～60ºC；所述反应时间为20～40分钟；其中的96孔板也可以换成普通石英比色皿进行检测。与现有技术相比较，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术方法可避免常规的游离蛋白/多肽分子的分离或去除步骤，能一步快速直接测量出脂质囊泡中游离蛋白和总蛋白的含量，从而计算出脂质囊泡中的蛋白包封率，适合大规模脂质囊泡包裹蛋白/多肽的处方工艺筛选时，包封率的快速测定和比较。其原理是BCA反应试剂中含有铜离子，已知二价铜离子在碱性的条件下，被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和二喹啉甲酸（BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此由吸光值可以推算出蛋白浓度。根据上述反应原理，一方面利用脂质囊泡外游离蛋白的催化作用，使BCA与铜离子发生显色反应，根据吸光度值可以计算出游离蛋白的浓度C游；另一方面，由于脂质囊泡结构的密封性，铜离子无法顺利与脂质囊泡内的包裹蛋白发生作用，只有当通过表面活性剂对脂质囊泡进行溶解破坏，释放出脂质囊泡中包裹的蛋白之后，才能与游离蛋白一起与铜离子和BCA发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法，其特征在于，利用脂质囊泡内外蛋白或多肽与显色试剂的反应速率差异实现包封率的计算，所述方法包括以下步骤：（1）常规制备包裹有蛋白或多肽的脂质囊泡；（2）将步骤（1）中的脂质囊泡中的总蛋白浓度稀释到合适范围内；（3）取一定量步骤（2）中的脂质囊泡溶液，加入破乳剂，使脂质囊泡溶解；（4）将步骤（2）和步骤（3）中的脂质囊泡溶液，分别加至96孔板，再在每孔中加入能与蛋白或多肽进行显色反应的试剂；（5）在步骤（4）中所述的96孔板的标准品孔中分别加入牛血清白蛋白标准品，再加入能与蛋白或多肽进行显色反应的试剂；（6）将步骤（5）的96孔板在一定温度下反应一段时间，直至出现颜色变化；（7）将步骤（6）的96孔板放置于酶标仪，读取吸光度值；计算各孔蛋白浓度；（8）根据各孔蛋白浓度计算包封率。

【技术特征摘要】
1.一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法，其特征在于，利用脂质囊泡内外蛋白或多肽与显色试剂的反应速率差异实现包封率的计算，所述方法包括以下步骤：（1）常规制备包裹有蛋白或多肽的脂质囊泡；（2）将步骤（1）中的脂质囊泡中的总蛋白浓度稀释到合适范围内；（3）取一定量步骤（2）中的脂质囊泡溶液，加入破乳剂，使脂质囊泡溶解；（4）将步骤（2）和步骤（3）中的脂质囊泡溶液，分别加至96孔板，再在每孔中加入能与蛋白或多肽进行显色反应的试剂；（5）在步骤（4）中所述的96孔板的标准品孔中分别加入牛血清白蛋白标准品，再加入能与蛋白或多肽进行显色反应的试剂；（6）将步骤（5）的96孔板在一定温度下反应一段时间，直至出现颜色变化；（7）将步骤（6）的96孔板放置于酶标仪，读取吸光度值；计算各孔蛋白浓度；（8）根据各孔蛋白浓度计算包封率。2.根据权利要求1所述的一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法，其特征在于，步骤（2）所述稀释后的脂质囊泡中总蛋白浓度为20～1000μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法，其特征在于，步骤（3）所述破乳剂为包括且不限于TritonX-100、Tween20或Tween80等非离子表面活性剂和其他类...

【专利技术属性】
技术研发人员：张义浜，许化溪，曹方引，冯雪，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32