脂质体包封的DNA口服疫苗制造技术

一种口服疫苗，包括脂质体和结合或优选包裹于脂质体中可有效编码抗原的ＤＮＡ，其中脂质体由包括阳离子化合物和两性离子型磷脂的组分所制得。所述脂质体形成化合物中的疏水基必须包括至少一种饱和基团，这提高了化合物的相变温度，使脂质体在口服给药中更加稳定。研究表明，该组合物可提高分泌型免疫球蛋白ＩｇＡ的水平，这对于实施有效的口服疫苗给药是关键的。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及包括阳离子脂质体和结合或包裹于脂质体中的核酸的口服疫苗，所述核酸是一种基因疫苗，它可有效地编码诱发期望免疫反应的抗原。WO-A-9810748描述一种含有基因疫苗，它含有可有效地编码诱发期望免疫反应的抗原的核酸，所述核酸是包裹于脂质体中的。其中脂质体由包括阳离子类脂的组分所制得。该组合物据称适于经口服给药，但是在其实施例却采用了肌内、皮下、静脉内或腹膜内途径给药。该组合物与肠道中的淋巴系统作用，才能使口服给予的疫苗产生免疫应答。因此，疫苗在胃肠道中必须稳定，并且必须在被胆盐破坏以前保持足够的稳定性以便与系统中的有关细胞作用。很明显，口服给予疫苗比注射可取。本专利技术涉及适于口服给予疫苗的组合物、和经口服给予疫苗而对人类或非人类动物进行预防接种的方法。首先，本专利技术提供了一种新型疫苗，其中包括结合和/或包裹于脂质体中可有效地编码抗原的核酸，所述脂质体由包括以下物质的组分所制得a)至少一种式I阳离子化合物，R1OCH2CH(OR2)CH2R5X1R6nI其中R1和R2相同或不同，选自式CH3(CH2)a(CH＝CH-CH2)b(CH2)c(CO)d-其中b为0-6，每一a和c选自0-23，(a+C+3b)为12-23，和d为0或1；R5为化学键或C1-8亚烷基(alkanediyl)C1-4烷氧基-C1-4烷基基团，或C1-8氧-亚烷基基团；X1为N、P或S；X1为N或P时n为3，X1为S时n为2；和基团R6相同或不同，选自氢、C1-8烷基、C6-12芳香基或芳烷基，或者2或3个基团R6与X1形成饱和或不饱和的5-7元杂环基团；b)至少一种式II两性离子型磷脂 其中R3和R4相同或不同，选自式CH3(CH2)e(CH＝CH-CH2)f(CH2)g-，其中f为0-6，每一e和g为0-23，和(e+g+3f)为12-23；R7为C1-8亚烷基基团；Y为-O-或化学键；X2为N、P或S；X2为N或P时m为3，X2为S时m为2；和基团R8相同或不同，选自氢、C1-8烷基、C6-11芳香基或芳烷基，或者2或3个基团R8与X2可形成饱和或不饱和的5-7元杂环基团；其条件是R1、R2、R3和R4中的至少一种基团的b或f为0。所述组合物优选为口服疫苗，本专利技术还涉及经口服给予疫苗的方法。该组合物可包括药用稀释剂，及可提高疫苗免疫原性能的组分例如常规佐剂。在本专利技术中，条件是R1、R2、R3和R4中的至少一种基团具有饱和长烷基链，这可使组合物具有相对高的相变温度。这样，可使脂质体形成组分的混合物的相变温度至少为37℃，优选为38-50℃。在另一个优选实施方案中，基团R1和R2可彼此相同，基团R3和R4也彼此相同。我们发现，R1、R2为不饱和基团而R3、R4是饱和基团时是可取的，反之亦然。阳离子化合物包括单一的式I化合物。在一个特定实施方案中，本专利技术脂质体形成组分中采用了式II中不同结构的两种两性离子型磷脂。在一个实施方案，采用了这样的化合物，其中第一种两性离子型磷脂的基团R3和R4相同，其中f为1，e+g为14-20、优选14-18。优选不饱和基团位于R3或R4的中间，即e≈9，优选e＝g＝7。烯键一般为顺式。在另一实施方案，混合物中的第一种磷脂采用了磷脂混合物，其中基团R8相同且优选均为氢。在式II的第二种磷脂中，基团R8均为C1-4-烷基。在该实施方案中，两种磷脂的f一般为0。通常，在上述采用第一与第二磷脂混合物的两个实施方案中，Y为0和X2为N。此外，R7优选为C2-3-亚烷基。在式I的阳离子化合物中，疏水基R1和R2可通过醚键(d＝0)或酯键(d＝1)与分子其他部分连接。优选式I化合物中的R5为C1-4-亚烷基。优选所述阳离子化合物主要为阳离子，即在似于体内pH5-9的条件下基本上完全电离。优选每个基团R6不是氢而是C1-4-烷基，最优选每个基团R6为甲基。R5优选为化学键或亚甲基。在一个特别优选实施方案中，本专利技术组合物使用了式I所示的阳离子化合物(1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲氨基)丙烷(DOTAP))，其中每个基团R1和R2为油酰基，基团R5为化学键，X1为N和每个基团R6为甲基。另一阳离子化合物为其相似化合物，其中以油基取代疏水性油酰基，即用醚键而非酯键连接。含有饱和疏水基的适宜阳离子化合物为1，2-二(十六烷基氧基)-3-三甲铵丙烷(BisHOP)。适宜的两性离子型磷脂包括二油酰氧基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰氧基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰氧基磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)及其混合物。两性离子型磷脂混合物特别优选包括二硬脂酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰乙醇胺。两种两性离子型磷脂的混合物通常包括重量比为10∶1-1∶10、最优选为5∶1-1∶5、更优选2∶1-1∶2的两种化合物。优选混合物中饱和基团R3和R4的比例至少为50％。通常， 阳离子化合物与两性离子型磷脂(总量)的比例为10∶1-1∶20、更优选为5∶1-1∶10、更优选为1∶1-1∶5。本专利技术另一方面提供了一种口服疫苗，其中包括结合和/或包裹于脂质体中可编码抗原的核酸，所述脂质体形成组分包括至少一种甘油类脂(glycerolipid)、至少一种阳离子化合物和至少一种两性离子型磷脂，其特征在于所述甘油类脂为O，O’-二烷酰基或O，O’-二烷基磷脂。优选甘油类脂为上述式II化合物，其中R3和R4的f均为0。在本专利技术所有方面中，联用的脂质体形成组分的相变温度优选至少为37℃。采用差示扫描量热法测定相变温度。在这方面，本专利技术两性离子型磷脂优选包括类脂混合物，例如包括饱和与不饱和类脂的混合物，和/或磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺的混合物。阳离子化合物优选为2，3-二(酰氧基或烷氧基)取代的丙胺衍生物，例如具有式I结构的化合物。另外，化合物可由简单的阳离子两亲化合物例如单-或-硬脂胺或其他长链烷基胺，或其分别具有1、2或3个N-低级烷基(C1-4-烷基)取代基的仲、叔或季铵衍生物制得，例如二甲基双十八卤化铵。另一类适于掺入脂质体中的两亲阳离子化合物，是与二(脂酰)甘油酯或N，N-二(C12-24)烷基酰基酰胺化合物结合的精胺共轭物、或者3β-胆固醇(DC-chol)。一些适宜的阳离子两亲化合物可参见KabanovA.V.等在BioconjugateChem.(1995)，6(1)，7-20中的描述，其公开内容在此引入作为参考。本专利技术另一方面提供了一种口服疫苗，其中包括结合和/或包裹于脂质体中可编码抗原的核酸，所述脂质体形成组分包括至少一种阳离子化合物和至少一种两性离子型磷脂，其特征在于所述脂质体形成组分包括至少25摩尔％、优选至少50摩尔％的独立相变温度高于40℃的化合物。在这方面，本专利技术中具有高相变温度的脂类化合物的含量相对较高，这样就使脂质体形成组分混合物的相变温度高于37℃。混合物的相变温度应接近于每种化合物相变温度的均值。一般很容易测定每种化合物的相变温度，并且许多化合物的相变温度是已知的。高相变温度的两性离子型磷脂优选为DPPC(Tc＝41.4℃)、DSPC(Tc＝55.1℃)、DPPE(Tc＝64℃)和DSPE(Tc＝74.2℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口服疫苗，包括结合或包裹于脂质体中可有效编码抗原的核酸，其中脂质体由包括以下物质的组分所制得： ａ）至少一种式Ⅰ阳离子化合物， Ｒ↑［１］ＯＣＨ↓［２］ＣＨ（ＯＲ↑［２］）ＣＨ↓［２］Ｒ↑［５］Ｘ↑［１］Ｒ↑［６］↓［ｎ］ Ⅰ 其中Ｒ↑［１］和Ｒ↑［２］相同或不同，选自式ＣＨ↓［３］（ＣＨ↓［２］）↓［ａ］（ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ↓［２］）↓［ｂ］（ＣＨ↓［２］）↓［ｃ］（ＣＯ）↓［ｄ］↑［－］ 其中ｂ为０－６，每一ａ和ｃ选自０－２３，（ａ＋Ｃ＋３ｂ）为１２－２３，和ｄ为０或１； Ｒ↑［５］为化学键或Ｃ↓［１－８］亚烷基基团； Ｘ↑［１］为Ｎ、Ｐ或Ｓ； Ｘ↑［１］为Ｎ或Ｐ时ｎ为３，Ｘ↑［１］为Ｓ时ｎ为２；和 基团Ｒ↑［６］相同或不同，选自氢、Ｃ↓［１－８］烷基、Ｃ↓［６－１２］芳香基或芳烷基，或者２或３个基团Ｒ↑［６］与Ｘ↑［１］形成的饱和或不饱和５－７元杂环基团； ｂ）至少一种式Ⅱ两性离子型磷脂 Ｒ↑［１３］ＣＯＯＣＨ↓［２］ＣＨ（ＯＣＯＲ↑［１４］）ＣＨ↓［２］Ｏ.＊－Ｙ↑［１］－＊Ｘ↑［３］Ｒ↑［１８］↓［ｐ］ Ⅲ 其中Ｒ↑［３］和Ｒ↑［４］相同或不同，选自式ＣＨ↓［３］（ＣＨ↓［２］）↓［ｅ］（ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ↓［２］）↓［ｆ］（ＣＨ↓［２］）↓［ｇ］↑［－］， 其中ｆ为０－６，每一ｅ和ｇ为０－２３，和（ｅ＋ｇ＋３ｆ）为１２－２３； Ｒ↑［７］为Ｃ↓［１－８］亚烷基基团； Ｙ为－Ｏ－或化学键； Ｘ↑［２］为Ｎ、Ｐ或Ｓ； Ｘ↑［２］为Ｎ或Ｐ时ｍ为３，Ｘ↑［２］为Ｓ时ｍ为２；和 基团Ｒ↑［８］相同或不同，选自氢、Ｃ↓［１－８］烷基、Ｃ↓［６－１１］芳香基或芳烷基，或者２或３个基团Ｒ↑［８］与Ｘ↑［２］可形成的饱和或不饱和５－７元杂环基团； 其条件是Ｒ↑［１］、Ｒ↑［２］、Ｒ↑［３］和Ｒ↑［４］中至少一种基团的ｂ或ｆ为０。...

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：G格雷格里亚迪斯，Y佩里尔，
申请(专利权)人：利普森技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]