免疫学上重要的单纯疱疹病毒抗原制造技术

本发明专利技术提供了可用于预防和治疗ＨＳＶ感染的ＨＳＶ抗原。本文公开了经确认可由疱疹病变衍生的Ｔ细胞识别的表位。对本发明专利技术抗原具有特异性的Ｔ细胞已经证明对装载了由病毒编码的肽表位的细胞有细胞毒性，而且在许多情况中对受ＨＳＶ感染的细胞有细胞毒性。负责Ｔ细胞特异性的免疫原性抗原的鉴定提供了改良的抗病毒治疗和预防策略。包含本发明专利技术抗原或其编码多核苷酸的组合物为预防和治疗ＨＳＶ感染提供了有效靶向的疫苗。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可用于治疗和预防HSV感染的分子、组合物、和方法。更具体的说，本专利技术鉴定了HSV蛋白质的表位，可用于开发具有HSV特异性T细胞(特别是CD8+T细胞)的抗原特异性的方法、分子、和组合物。
技术介绍
在人体中需要细胞免疫应答来限制复发型HSV感染的严重程度。最初的生殖性HSV-2感染是漫长且严重的；而复发型较不严重，且常常没有症状。原发型HSV-2感染的消退与抗原特异性T细胞的渗透有关，包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。人体中复发型HSV-2感染的连续病变活组织标本研究显示随着病变成熟而趋向CD8+优势的变化和局部CTL活性与病毒清除的相关性(D.M.Koelle等人，1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)1011500-1508；A.L.Cunningham等人，1985，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)75226-233)。因而，由CD8+CTL识别的HSV抗原可用于新的疗法和疫苗。单纯疱疹病毒(HSV)的完整DNA序列为大约150kb，编码大约85个已知基因，这些基因编码的蛋白质的长度范围为50-1000个氨基酸。这些蛋白质中能够引发针对病毒感染的有效T细胞免疫应答、长度为大约9-12个氨基酸的免疫原性表位是未知的。仍然需要鉴定能够引发针对HSV感染的有效免疫应答的特异性表位。这种信息将导致可用于预防和治疗HSV感染的更有效的免疫原性抗原的鉴定。专利技术概述本专利技术提供了HSV抗原、包含HSV抗原的多肽、编码该多肽的多核苷酸、包含多核苷酸的载体和重组病毒、呈递多肽的抗原呈递细胞(APC)、针对HSV的免疫细胞、和制药学组合物。制药学组合物可用于预防和治疗。本专利技术的抗原可被由疱疹病变回收的T细胞识别。本专利技术还提供了多种方法，包括用于预防和治疗HSV感染的方法、用于杀死受HSV感染的细胞的方法、用于抑制病毒复制的方法、用于增强抗病毒和/或免疫调控淋巴因子分泌的方法、和用于增强HSV特异性抗体生成的方法。为了预防和治疗HSV感染、增强抗病毒和/或免疫调控淋巴因子分泌、增强HSV特异性抗体生成、和总体上刺激和/或提高HSV特异性免疫力，本专利技术的方法包括对对象施用本专利技术的多肽、多核苷酸、重组病毒、APC、免疫细胞、或组合物。用于杀死受HSV感染的细胞和用于抑制病毒复制的方法包括使受HSV感染的细胞接触本专利技术的免疫细胞。本专利技术的免疫细胞是经过本专利技术抗原或呈递本专利技术抗原的APC刺激的细胞。本专利技术还提供了用于生成这些免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞接触经修饰而呈递本专利技术抗原的APC，优选树突细胞。在优选的实施方案中，免疫细胞是T细胞，诸如CD4+或CD8+T细胞。在一个实施方案中，本专利技术提供了包含HSV多肽的组合物。多肽包含ICP0或UL47蛋白质或其片段。在一个实施方案中，片段包含ICP0的第92-101位氨基酸或其替代型变体。在另一个实施方案中，片段包含UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、和/或551-561位氨基酸或其替代型变体。本专利技术还提供了编码本专利技术多肽的分离多核苷酸，和包含多核苷酸的组合物。本专利技术还提供了经遗传修饰而表达本专利技术多核苷酸的重组病毒，和包含重组病毒的组合物。在优选的实施方案中，病毒是痘苗病毒、金丝雀痘病毒(canary pox virus)、HSV、慢病毒、逆转录病毒、或腺病毒。本专利技术的组合物可以是制药学组合物。组合物可任选包含制药学可接受载体和/或佐剂。本专利技术还提供了用于鉴定感染性生物体(诸如病毒、细菌、或寄生虫)的免疫原性表位的方法。感染性生物体优选病毒，诸如HSV。在一个实施方案中，本专利技术的方法包括制备该生物体基因组的随机片段集合。可使用多种标准方法来制备片段，包括但不限于限制酶消化和机械片段化，诸如受控超声处理(E.Mougneau等人，1995，科学(Science)268563-566)。在优选的实施方案中，生物体是HSV-2，并通过Sau3AI消化来制备病毒基因组片段。可使用的其它限制酶的范例包括但不限于ApaI、SmaI、和AluI。然后将基因组DNA片段连接到载体中，优选通过部分补平反应。优选载体是pcDNA3.1(+)his系列的成员。然后使用常规技术表达片段。优选使用Cos-7转染法进行表达(E.De Plaen等人，在I.Lefkowits编的《免疫学方法手册》(ImmunologyMethods Manual)一书中，第2版，纽约，Academic出版社，1997，第691-718页)。可使用能够呈递靶抗原的适当HLA分子共转染Cos-7细胞。然后测定表达的多肽引发细胞免疫应答的能力。引发细胞免疫应答的能力是存在免疫原性表位的指征。可用于检测引发细胞免疫应答能力的测定法包括但不限于细胞毒性测定法和淋巴因子分泌测定法。在一个实施方案中，测定法是γ-干扰素测定法。在优选的实施方案中，本专利技术提供了用于鉴定具有针对CD8+T细胞的免疫原性的HSV表位的方法。该方法包括由HSV病变获得CD8+T细胞，并测定获得的T细胞以鉴定有能力识别受HSV感染的细胞的T细胞。该方法还包括由HSV获得核酸制剂并片段化，表达获得的核酸的一种或多种片段，并对表达的片段测定针对经鉴定HSV特异性T细胞的抗原反应性。将对HSV特异性T细胞有反应性的表达片段鉴定为编码针对CD8+T细胞有免疫原性的HSV表位。可使用基因组片段的子片段重复上述步骤。该方法还可包括将基因组片段测序。在一个实施方案中，T细胞测定法包括进行细胞毒性测定法或γ-干扰素测定法。可使用由已暴露于感染性生物体的对象衍生的免疫细胞进行测定。在优选的实施方案中，细胞是由受感染对象的活性感染位点(诸如皮肤或子宫颈)或血液衍生的。本专利技术还提供了经本专利技术方法鉴定的免疫原性表位、包含表位的多肽、和编码多肽的多核苷酸。合适的感染性生物体包括细菌、寄生虫、和病毒。病毒的范例包括DNA和RNA病毒，或是双链或是单链。本专利技术的方法提供了用于抗击多种感染性生物体(包括展示显著可变性的感染性生物体)的策略，而无需知道该生物体的具体核酸序列。图的简述附图说明图1A显示了来自受试者RW、CD8富集的大批PBMC中TCR Cβ-VβPCR产物(显示了24个Vβ家族中的12个)的荧光检测。将两种Vβ引物(所示)用于每道的双重分析。X轴顶部显示的PCR产物的分子量基于荧光标记。Y轴相对荧光强度。图1B显示了来自原发型HSV-2活组织标本的CD8富集的大批病变渗透淋巴细胞LIL中TCR Cβ-Vβ PCR产物(显示了24个Vβ家族中的12个)的荧光检测。将两种Vβ引物(所示)用于每道的双重分析。X轴顶部显示的PCR产物的分子量基于荧光标记。Y轴相对荧光强度。图2A显示了大批扩增的由子宫颈刷细胞衍生的淋巴细胞的增殖应答。图2B显示了大批扩增的由子宫颈刷细胞衍生的淋巴细胞的细胞毒性应答，以特异性释放百分比作图。图3是由HSV-2 DNA的Sau3AI文库(第2条线)分离的阳性基因组克隆的示意图，该克隆包含部分ICP0基因。将基因组克隆转染到细胞中，并将引物A用于cDNA合成。外显子1/外显子2C-A(第5条线)和HLA B45cDNA在转染到Cos-7细胞中后刺激T细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）多肽和制药学可接受载体的制药学组合物，其中所述多肽包含ＩＣＰＯ或Ｕ↓［Ｌ］４７蛋白质或其片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DM科勒，陈洪波，L科里，NA赫斯肯，P麦克戈温，SP福林，CM波萨瓦德，
申请(专利权)人：华盛顿大学，科里克萨有限公司，弗雷德哈钦森癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：US[美国]