本发明专利技术属于免疫生物学领域，涉及一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用。具体的，涉及一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽，其具有如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5任一序列所示的氨基酸序列，或上述序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明专利技术还涉及所述免疫原性多肽的制备方法和在制备EV71病毒的诊断试剂中的用途。本发明专利技术的免疫原性多肽具有良好的抗原性和免疫原性，为EV71的早期诊断试剂开发和疫苗研发提供了研究基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫生物学
，具体设及一种肠道病毒71型VPl抗原的免疫原 性多肤及其制备方法与应用。
技术介绍
EV71是单股正链RNA病毒，从属于小RNA病毒科肠道病毒A属，其感染可引起婴幼 儿手足口病，发病时主要表现为发热、腹泻及瘤疹性咽峡炎。与典型手足口病不同的是，某 些EV71毒株感染可引起重症手足口病，并发症包括无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻 搏、神经源性肺水肿甚至死亡。EV71感染发病广泛，其流行范围波及亚洲、欧洲、北美洲、澳 洲等，死亡率高，是目前颇受重视的公共卫生问题。 多年来，各国学者一直致力于EV71疫苗的研发，随着分子生物学及免疫学等多学 科的交叉发展，EV71的重组亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒疫苗相继问世。其中EV71 传统全灭活疫苗发展最为迅速，目前中国有S家机构已完成EV71全灭活疫苗的III期临床 试验。但全灭活疫苗存在诸多问题，例如免疫效果一般较低，无法诱导细胞毒T淋己细胞反 应，诱导产生的免疫反应持续时间较短，灭活剂对病毒抗原存在影响等；所W亟需研发新型 疫苗，在保留完整免疫原性的同时有效刺激免疫应答，同时避免感染。 关于EV71的感染诊断，传统方法包括中和实验法及病毒分离法，W上方法费时费 力，实验要求较高，不适于临床应用。近年来，分子生物学检测技术（如逆转录聚合酶链式 反应（RT-PCR)、实时巧光定量聚合酶链式反应（如antitativeReal-timePCR))用于诊断 EV71感染的应用越来越多，但是此类方法存在假阳性及假阴性，对实验技术要求较高，不易 在基层医院开展。而酶联免疫吸附法巧LISA)及免疫层析法（ICA)利用抗原抗体结合的原 理进行EV71的检测，操作简单快速，目前有不少相关研究，但尚未在临床上推广。EV71可分为A、B、CS个亚型，其中B及C亚型又可分别分为B1-B5及Cl-巧型。 EV71仅含一个开放阅读框（openreadingframe, 0RF)，ORF的上下游分别为5'UTR和 3'UTR。基因组RNA全长约含7500个核巧酸，编码具有2193个氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋 白可^水解为？1、？2、口3^个前体蛋白，最终水解为4个结构蛋白（￥口1-￥口4)和7个非结构 蛋白（2A-2C、3A-3D)。4个结构蛋白中，VP4包埋于病毒外壳的内侧，其余S个均暴露于病 毒颗粒表面，直接接触宿主免疫系统；其中VPl蛋白具有与血清型相对应的遗传多样性，包 含EV71主要的抗原决定簇，因此VPl是目前研究的热点之一，已被广泛应用于手足口病的 病原检测及疫苗研究。[000引 VPl蛋白的BCloop区巧1-106氨基酸位点）是目前公认的中和抗原决定簇位点， 但是否还存在其他重要的抗原决定簇尚需进一步的研究论证。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种肠道病毒71型VPl抗原的免疫原性 多肤及其制备方法与应用。将VPl蛋白进行分割，研究各肤段的抗原性及免疫原性，为EV71 的早期诊断试剂和疫苗研发提供基础研究。[000引为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 本专利技术的一个方面设及一种肠道病毒71型VPl抗原的免疫原性多肤，其具有如序 列表中SEQIDNO.I-SEQIDNO. 5任一序列所示的氨基酸序列，或上述序列经替换、缺失或 添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。 本专利技术的再一个方面设及编码上述免疫原性多肤的多核巧酸；具体的，所述多核 巧酸的序列分别如沈QIDNO. 6-SEQIDNO. 10所示。 本专利技术还提供含有上述多核巧酸序列的重组载体。 前述的重组载体，其出发载体为祀T-49b(+)。 本专利技术还提供含有上述重组载体的重组表达菌。 前述的重组表达菌，其出发菌株为大肠杆菌DE3。 本专利技术还提供肠道病毒71型VPl抗原的免疫原性多肤的表达和纯化方法，其包括 如下步骤： (1)将沈QIDNO. 6-SEQIDNO. 10所示的基因片段和载体祀T-49b(+)，经SpeI 及HandIII双酶切后，连接构建得到表达载体祀T-49b(+) -VPl、祀T-49b(+) -VPl79 432、 祀T-49b(+) -VPl436 864、祀T-49b(+) -VPl436 73日和祀T-49b(+)-VPl5肋86S 0)将步骤（1)的表达载体pET-49b(+)-VPl、pET-49b(+)-VPl? 432、 祀T-49b(+) -VPl436 864、祀T-49b(+) -VPl436ns和祀T-49b(+)-VPlses864转化至大肠杆菌DE3， 筛选阳性克隆，诱导表达重组蛋白； (3)将步骤（2)的重组蛋白采用谷脫甘肤琉基转移酶（GST)琼脂糖凝胶纯化，即 得。 步骤（1)中，SEQIDNO. 6-SEQIDNO. 10所示的基因片段的构建方法为：W SDLY107 (GenBank:JX244186. 1)全长cDNA为PCR模板，W沈QIDNO. 11-沈QIDNO. 20 所 示的引物序列为扩增引物，经PCR扩增得到VPl基因全长片段及4段VPl基因片段，分别为 VPlVPl79 432YPl436 864YPl436 735和YPl565 864 扩增的引物序列具体如下：[002。SpeIVPlPrimerF:5' -CGGACTAGTGGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTG-3'；（SEQID NO. 11)； HindIIIVPlPrimerR:5, -CCCAAGCTTCTAAAGAGTGGTGATCGCTGTGCG-3,；（SEQID NO. 12)；IVPlSpeIPrimerF:5，-CGGACTAGTATGCCCACAGGCCAGAACACACAGGTGA-3，；（SEQID NO. 13)；IVPlHindIIIPrimerR:5'-CCCAAGCTTCTACCCGGTGGGTGTGCACGCAACAAAA-3，；（SEQ IDNO. 14)；2VPlSpeIPrimerF:5,-CGGACTAGTATGGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATA-3，；（SEQIDNO.巧）； 2VPlHindIIIPrimerR:5，-CCCAAGCTTCTAACCAGTTGGCTTAATGGAGTTG-3，；（SEQID NO. 16)； 3VPlSpeIPrimerF:5'-CGGACTAGTGTTGTCCCACAATTGCTCCAATA-3,；（SEQID NO. 17)； 3VPlHandIIIPrimerR:5' -CCCAAGCTTCTAGTACTTGGACTTGGAGGTCC-3';(沈QID NO. 18)； 4VPlSpeIPrimerF: 5, -CGGACTAGTCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTC-3,；（SEQID NO. 19)； 4VPlHandIIIPrimerR:5' -CCCAAGCTTCTAACCAGTTGGCTTAATGGAGTT-3';(SEQID NO. 20)。 本专利技术还提供上述肠道病毒71型的VPl抗原的免疫原性多肤在制备EV71病毒的 诊断试剂中的应用。 本专利技术的有益效果： (1)本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽，其特征在于，其具有如序列表中SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.5任一序列所示的氨基酸序列，或上述序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：温红玲，郝树彬，马英伟，陶泽新，王志玉，庄志超，白永娟，王莉鸿，李纯，
申请(专利权)人：山东大学，山东省医疗器械产品质量检验中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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