本发明专利技术公开了一种丙型肝炎病毒核心抗原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，是由核苷酸序列为SEQ?ID?NO.2所示的DNA编码的多肽。一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为SC16-H6，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.5074。另一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为SC23-G5，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.5075。一种抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC?No.5074的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC?No.5075的杂交瘤细胞株分泌产生的，其对SEQ?ID?NO.1所示的多肽具有特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种针对我国丙型肝炎病毒感染流行株的核心抗原，以及对该抗原具有特异性的抗体，以及能够分泌产生该抗体的杂交瘤细胞株。
技术介绍
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)感染引起的传染病，已经成为继乙肝、艾滋病后又一种引起全球性关注的病毒性传染病。目前，全世界丙型肝炎病毒携带者约有1. 7亿人，且以300 400万人/年的速度递增；我国受感染者在6，000万人以上，平均感染率为3.2%，属中高流行区域，HCV基因型以Ib和加为主，其中Ib型占到70% 以上。HCV感染易慢性转化，80-85% HCV感染者发展为慢性丙型肝炎，其中20%发展为肝纤维化，最终有4-5%肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，是导致肝硬化、肝细胞性肝癌的重要因素。一些数据显示，未来20年内与HCV感染相关的死亡率将继续增加。及早对HCV 感染者进行诊断并给予正确治疗是减缓疾病进展、降低死亡率的关键。由于HCV高度变异且机体免疫与HCV感染的复杂机理使丙型肝炎疫苗的研制困难重重，短期内难有突破性进展。虽然干扰素对慢性丙型肝炎有一定疗效，但疗程长、价格昂贵、毒副作用大且易反弹。目前国内主要应用血清学的抗HCV/EIA检测抗体，由于窗口期的存在，经抗体筛选后，临床上仍有部分输血后丙肝发生。HCV病毒学的检测操作复杂、容易污染，价格昂贵，很难用于大规模筛查。建立高灵敏度、特异性和稳定性的HCV抗原早期检测方法，缩短检测窗口期，可有效防止传播，而获得高特异性的单克隆抗体又是其中的关键。丙型肝炎病毒基因组两端的非编码区及编码核心蛋白的区域是HCV基因组中最保守的区域。其N端前120个氨基酸构成了主要的亲水结构域，具有很强的免疫原性。该区氨基酸序列保守，含有多个线性表位， 不同病毒分离株的氨基酸约90%同源。高度保守的HCV核心蛋白是HCV早期诊断必不可少的抗原之一。制备针对我国HCV流行株的特异性鼠单克隆抗体，对丙型肝炎病毒核心抗原检测方法的建立具有重要意义和应用价值。采用鼠-鼠杂交瘤技术制备的单克隆抗体至今仍是诊断试剂的重要来源之一，技术较为成熟，因其特异性强，能够减少可能的交叉反应，从而可以提供较准确的检验结果， 均一性和生物活性单一性的优点也利于进行标准化和规范化的质量管理。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种针对我国丙型肝炎病毒感染流行株的核心抗原，以及对该抗原具有特异性的抗体，以及能够分泌产生该抗体的杂交瘤细胞株(两株)，本专利技术提供的单克隆抗体，能够高特异性地结合HCV核心抗原，具有较高的亲和力，可用于我国人群HCV早期诊断核心抗原检测试剂盒的研制。本专利技术是通过以下技术方案实现的3一种丙型肝炎病毒核心抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，是由核苷酸序列为SEQID NO. 2所示的DNA编码的多肽。一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株为SC16-H6，命名为鼠-鼠杂交瘤细胞，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5074。另一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株为SC23-G5，命名为鼠-鼠杂交瘤细胞，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5075。所述杂交瘤细胞株是由免疫的Balb/c小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、 筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系，能稳定分泌单克隆抗体。一种抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No. 5074的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC No. 5075的杂交瘤细胞株分泌产生的，其对SEQ ID NO. 1 所示的多肽具有特异性。一种制备所述单克隆抗体的方法，包括用SEQ ID NO. 1所示的多肽免疫Balb/c 小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQ ID NO. 1所示的多肽具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克隆抗体。本专利技术提供的丙型肝炎病毒核心抗原，是通过从我国HCV病人血清中提取RNA并克隆出的HCV核心区片段，为HCVlb/加亚型的核心区前3-120个氨基酸的蛋白，涵盖了多个线性表位，主要针对我国HCV感染流行株，可用于免疫小鼠制备单克隆抗体和免疫家兔制备多克隆抗体，其具有抗原性强、纯度高、稳定性好等优点。本专利技术提供的两株杂交瘤细胞株，能够稳定、高效分泌抗HCV鼠单克隆抗体，具有较高的亲和力，对建立HCV核心抗原检测方法具有重要的应用价值。本专利技术提供的单克隆抗体，可以用于检测丙型肝炎病毒核心抗原，也可以用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒含有与标记物结合的单克隆抗体，所述标记物为荧光标记物、放射性标记物或酶标记物。具体用途如下直接用途建立可以同时检测丙型肝炎病毒突变株和野生株在内的丙型肝炎病毒核心抗原的临床检测实验技术，包括ELISA，胶体金免疫渗析，多种丙型肝炎病毒抗原的固相与液相分析，以及多种免疫病理检测技术等。间接用途采用本专利技术提供的杂交瘤细胞株分泌抗体所开发的实验技术与试剂， 可广泛地用于丙型肝炎的基础、临床与流行病学研究。本专利技术的有益效果主要体现在提供了一种针对我国人群HCV的单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，在本专利技术基础上可建立灵敏、可靠的检测方法，为评估其对于诊断、预后及临床治疗效果检测提供了理论基础，具有重大应用前景。附图说明杂交瘤细胞株SC16-H6，命名为鼠-鼠杂交瘤细胞，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5074。杂交瘤细胞株SC23-G5，命名为鼠-鼠杂交瘤细胞，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5075。图1为抗原酶切电泳示意图。图2为蛋白抗原性western鉴定示意图。图3A为纯化蛋白电泳示意图。图3B为纯化蛋白western鉴定示意图。图4为抗原指数分析示意图。图5为染色体分析示意图。图6为单克隆抗体亚型电泳示意图。图7为单克隆抗体特异性鉴定示意图。具体实施例方式下面结合附图对专利技术作进一步的说明。实施例一免疫原的制备1.设计并合成HCV核心区基因片段引物序列(由上海博尚生物技术有限公司合成)JnSEQ ID NO. 3、4 所示。2.提取HCV感染患者(用于HCV RNA提取的20例HCV血清样本来自山东大学齐鲁医院收集的HCV-RNA阳性但HCV抗体阴性患者，其中男性16例，女性4例，平均年龄45 岁，经基因分型检测结果为13例Ib亚型，7例2a亚型)血清RNA，进行逆转录PCR，反应体系如下引物(特异性引物) 2μ1 cDNA1.5μ1Mix12.5μ1DEPC9μ1按下述条件进行PCR反应941308，551308，721308，35个循环后，721IOmin03.琼脂糖凝胶电泳后胶回收目的PCR产物与pMDIS-T载体连接，转化到DH5 α工程菌中。挑取单菌落摇菌抽提质粒，经酶切鉴定，对确认获得目的片段的工程菌进行测序鉴定。4.将重组本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种丙型肝炎病毒核心抗原，其特征在于：其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示，是由核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示的ＤＮＡ编码的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王传新，王丽丽，王顺，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：88
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