抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白产品制造技术

本发明专利技术涉及含有抗Ａ组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白，并具有其抗体活性的产品、保健品、药物；本发明专利技术的有效成分经精制，纯度高，活性高，是配制保健品和药物的理想用品，它们被应用于防治因Ａ组轮状病毒感染引起的婴幼儿腹泻病，特异性强，治愈率高，效果优于常规药。同时还提供一种高效的活性检测方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域的免疫球蛋白产品，尤其是一种关于鸡蛋卵黄免疫球蛋白(IgY)产品，该产品具有较高的抗轮状病毒活性，而且本专利技术涉及含有该产品或由它们组成的保健品和药物以及应用它们防治因A组轮状病毒感染引起的婴幼儿腹泻病。轮状病毒遍及全球，是小儿腹泻病的重要病因，世界每年大约有90万人死于该病。经调查表明我国每年五岁以下小儿腹泻病患达2.5亿人次，其中相当大的比例因A组轮状病毒感染引起。对于该病多年来除采用口服或静脉注射补液纠正脱水之外还无特异性疗法。在预防方面，轮状病毒疫苗的使用还处在实验阶段，而且由于婴幼儿免疫系统发育还不完全，特异的抗轮状病毒免疫反应在消化系统发挥作用还存有障碍。当前，已有少数学者利用免疫球蛋白制剂(IgG)治疗和预防轮状病毒感染取得了显著疗效。当用抗原免疫产卵母鸡后，鸡可产生相应的抗体转移和积累于卵黄中，此抗体即为卵黄免疫球蛋白(IgY)。用A组轮状病毒抗原免疫鸡，10天后收集所产卵，并通过一定步骤可得到相应的抗A组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(抗—ARV IgY)。与IgG相比，IgY产量大，均一性好，IgY不会激活哺乳动物的补体系统，鸡属于鸟类，与哺乳动物间种系发生距离大，IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清反应，因而IgY用于免疫检测试验比用动物制备抗体更经济、方便。IgY的纯度在诊断、防治疾病方面有着较高的要求。抗—ARV IgY的分离提纯，主要困难是如何有效去除卵黄中所含高浓度的脂类，讫今已公开了不少分离、提纯抗—ARV IgY的方法，其主要过程是去除脂类，分离纯化，浓缩终产物。如用氯仿、丙三醇、丙酮等有机溶剂去除磷脂蛋白复合物，再借盐析、超速离心等方法提取抗—ARV IgY。这些方法因提取物中残留有机溶剂及其它一些化学物质对人、动物和环境会造成不利影响，而且操作过程复杂，产率与纯度低，故而限制了其应用。抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白用于牛、鼠等动物，实验表明预防和治疗动物腹泻都有良好效果，但牛轮状病毒与人轮状病毒有一定的区别，而且只有动物实验，没有人体临床实验结果，目前还未见将抗—ARV IgY产品制成保健品和药品用于人体。本专利技术的目的在于克服上述缺点，提供一种含有抗A组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(抗—ARV IgY)，并具有其抗体活性的产品、保健品和药物，且应用它们防治因A组轮状病毒感染引起的婴幼儿腹泻病，同时还提供抗—ARV IgY的ELIAS阻断检验方法。本专利技术的技术方案是这样实现的以A组轮状病毒抗原皮下注射免疫产蛋母鸡10天后收集其所产卵黄，通过已知的提取抗—ARV IgY粗品的方法得到粗品，再经下述步骤纯化a.将粗提抗—ARV IgY过DEAE-Sephadex A50凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥再溶解；b.过Sephadex G200凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥得到抗—ARV IgY纯品。在a、b两步骤中采取下述措施有利于提纯将粗提抗—ARV IgY过DEAE-Sephadex A50凝胶色谱柱后，以0.01M的内含0.01M-0.14M线性NaCl浓度的PH为6.8的PB磷酸缓冲液洗脱，流速为20毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰，收集液于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后用PB缓冲液溶解。中间产物过Sephadex G200凝胶色谱柱后以0.01M，PH7.0的PBS缓冲液洗脱，流速为11～13毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后即得纯品。抗—ARV IgY是防治A组轮状病毒引起的腹泻病的有效成份，其纯度越高对防治越有利。而有效含量在10％以上都有一定的效果，常用的有30％～50％，而85％～98％用于配药是最好的。只有具有抗体活性的抗—ARV IgY产品才有效果，其活性与免疫用的抗原种类和数量有关，建立检验抗—ARV IgY活性的方法对其应用有重要意义，本专利技术采用的ELIAS阻断试验方法，灵敏度高，能快速测定活性，且能半定量测定含量，样品用量少，而以往的各种活性检测灵敏度差，准确性差，样品消耗大。抗—ARV IgY的有效应用因此受到阻碍。用于人体的保健品和药物必须经过严格的毒理实验和临床实验，仅有防治疾病的动物实验是不够的。抗—ARV IgY有效成份配以常用的辅料，例如食用单糖或多糖，以及其他风味剂可作成保健品，增强婴幼儿预防A组轮状病毒侵害的能力；也可以配以食用单糖或多糖以及其他常用的药用辅料，作为防治A组轮状病毒引起的腹泻病的药物。本专利技术所提供的抗—ARV IgY产品经离子交换层析及凝胶过滤层析，纯度大于99.9％，是配制保健品和药物的理想原材料，因抗—ARV IgY特异性强，纯度高的抗—ARV IgY可用于多种试验中，如双向免疫扩散试验、单向免疫扩散试验，免疫电泳，火箭电泳，放射性同位素免疫试验。因其不会固定哺乳动物补体，不固定金黄色葡萄球菌A蛋白、不固定哺乳动物Fc受体，也不与类风湿因子发生特异性反应，高纯度的抗—ARV IgY在诊断婴幼儿轮状病毒腹泻病时效果远胜于其他免疫球蛋白。本明所提供的含抗—ARV IgY的保健品、药物经大量临床实验表明对婴幼儿轮状病毒感染具有被动免疫保护作用，治疗效果明显优于其他常规用药。经安全性试验表明安全无毒。本专利技术在提纯制备临床实验和安全性试验方面作了大量工作为抗—ARV IgY从实验室研究阶段走向保健品、药物的产业化提供了依据。下面结合实施例详细说明本专利技术实施例1选健康产卵良种母鸡隔离饲养一周后，将ARVIgY抗原悬浮液加入乳化剂充分乳化，鸡皮下多点注射，两周后再免疫注射一次。10天后产生免疫应答，所产蛋的卵黄中含有有效的抗—ARV IgY成份。收集所产卵黄，通过已知的提取抗—ARV IgY粗品的方法得到粗品，粗品纯度为15％～55％，再经下述步骤纯化a.将粗提抗—ARV IgY过DEAE-Sephadex A50凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥再溶解；b.过Sephadex G200凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥得到抗—ARV IgY纯品，纯度为99.2％。实施例2按实施例1的方法制备的纯品，在a步骤中，将粗提抗—ARV IgY过DEAE-Sephadex A50凝胶色谱柱后，以0.01M的内含0.01M-0.14M线性NaCl浓度的PH为6.8的PB磷酸缓冲液洗脱，流速为20毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰，收集液于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后用PB缓冲液溶解。实施例3按实施例1的方法制备的纯品，在b步骤中，中间产物过Sephadex G200凝胶色谱柱后以0.01M，PH7.0的PBS缓冲液洗脱，流速为11～13毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后即得纯品。实施例4将含有抗—ARV IgY有效成份的制品加其他辅料配制成抗—ARV IgY含量不少于10％的产品。实施例5将含有抗—ARV IgY有效成份的制品加其他辅料配制成抗—ARV IgY含量不少于30％的产品。实施例6将含有抗—ARV IgY有效成份的制品加其他辅料配制成抗—ARV IgY含量在30％～50％和85％～98％的产品。实施例7将实施例1-6中任何一项所述的产品制成保健品和药物，并用于预防和治疗A组轮状病毒引起的婴幼本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有抗体活性的抗Ａ组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白（抗－ＡＲＶＩｇＹ）的产品，其制备方法采用含Ａ组轮状病毒的抗原皮下注射免疫鸡１０天后收集其所产卵的卵黄，通过已知的提取抗－ＡＲＶＩｇＹ粗品的方法得到粗品，再经下述步骤纯化：ａ．将粗提抗－ＡＲＶＩｇＹ过ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ↓［５０］凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥再溶解；ｂ．过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ↓［２００］凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥得到抗－ＡＲＶＩｇＹ纯品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨荣鉴，钟青萍，熊勇华，杨宁生，陈红兵，
申请(专利权)人：中德联合研究院，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]