同时含有乙肝病毒和丙肝病毒核心抗原的双重抗原制造技术

利用基因重组技术，构建乙型肝炎病毒核心抗原（氨基酸１－１４４）与丙型肝炎病毒核心蛋白（氨基酸１－６９）或（氨基酸１－４０）基因融合的克隆，在大肠杆菌中表达可获得水溶性的、具有双重抗原性和免疫原性的融合蛋白颗粒。它可应用于乙肝和丙肝的预防、治疗、检测和抗体制备。含该融合基因的ＤＮＡ也可插入适当的表达载体直接应用于乙肝和丙肝的ＤＮＡ免疫和治疗。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用基因重组技术获得的肝炎病毒抗原，尤指乙肝病毒核心抗原和丙肝病毒核心蛋白基因的融合克隆，并表达获得的双重抗原。现已查明丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus，HCV)是引起输血后传染的非甲非乙肝炎的主要病原体。据统计，目前世界人口的1％已被HCV所感染，其中的25％为急性感染并出现黄疸，而其中的一半则将可能发展成慢性肝炎。而慢性感染者将发展演变为肝硬化和肝癌的可能性高达20％，因此危害性很大。同时，在世界范围内有3亿人口已被乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)所感染，如果不作适当预防和治疗可能会有1.4亿感染者将死于乙肝，同样，危害性也是十分大的。因此乙肝和丙肝的预防和治疗仍然是目前各国学者急待研究解决的重大课题。研制乙型肝炎疫苗、预防接种乙肝疫苗是目前预防乙肝流行的根本途径。同时应用疫苗于慢性乙肝的治疗方面当今已显露出一些可喜的结果。乙肝疫苗已由应用血源疫苗发展到基因工程重组乙肝表面抗原疫苗。而新型基因工程疫苗，即带多重免疫决定簇的基因工程表面抗原疫苗也正在研制中。近来研究表明，乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在原核和真核表达系统中均能自行组装成直径为27nm的颗粒(Pasek，M.等，Nature 1979，282，575；Roossinck，M.J.等，Mol.Cell.Biol.1986，6，1393)。颗粒具有良好的免疫原性和稳定性，在体内能诱导产生依赖T细胞和不依赖T细胞的高滴度的抗体(Milich，D.R.等，Science 1986，234，1398)。利用乙肝核心抗原为免疫载体蛋白在合适的位点融合外源片段已有一些成功的例子，如口蹄疫病毒(Clake，B.E.等，Nature 1987，330，381；Beeretag，K.M.等，Bio/Technology 1990，8，644)，脊髓灰质炎病毒(Clake，B.E.等，J.Gen.Virol.1990，71，1109)，乙肝病毒preSl(Schodel，F.等，J.Virol.1992，66，106)等等。他们发现HBcAg在外源片段融合后仍能形成颗粒，被融合片段的免疫原性有一定的提高。HCV研究由于起步较晚，目前尚未有合适的体外培养增殖系统，还不能直接研究其病毒蛋白。又由于HCV基因型变异多，而至今其保护性抗原尚未精确定位，因而目前HCV疫苗的研制仍未有重大突破。为防止HCV的传播，应加强对HCV感染的临床诊断和血源的检测。研制HCV疫苗、发展HCV的检测技术显得尤为重要。大量的研究者报道，不同来源的HCV核心蛋白基因被认为是最为保守的区域，且受感染人群大多数都有核心蛋白抗体。HCV核心蛋白在HCV预防和治疗中的作用受到人们的重视，但如何获得具有良好免疫原性的HCV核心蛋白的问题尚未得到解决。各种表达体系中尚未成功地发现所获得的HCV全核心蛋白形成颗粒结构。为此，本专利技术的目的是提供一种同时含有乙型肝炎病毒核心抗原与丙型肝炎病毒核心蛋白的双重抗原。该抗原是颗粒状融合蛋白，可通过一个含有HBcAg主要抗原决定簇基因(对应于1-144位氨基酸的乙肝病毒核心抗原基因)与HCV核心蛋白主要抗原决定簇基因(对应于1-69位氨基酸或1-40位氨基酸的丙肝病毒核心蛋白基因)的融合，再通过融合基因在大肠杆菌系统中表达后获得。本专利技术是一种同时含有乙肝病毒和丙肝病毒核心抗原的双重抗原，该抗原是通过融合基因表达获得的具有双重抗原的融合蛋白颗粒，所述融合基因是乙肝病毒核心抗原中去除羧端精氨酸富集区后的主要抗原决定簇基因即对应于1-144位氨基酸的乙肝病毒核心抗原基因与丙肝病毒核心蛋白主要抗原决定簇基因即与对应于1-69位氨基酸或1-40位氨基酸的丙肝病毒核心蛋白基因的融合。本专利技术选用羧端精氨酸富集区去除的HBcAg主要抗原决定簇作为载体，它的去除不影响HBcAg装配成颗粒的性质，也不影响其抗原性和免疫原性，然而，羧端被融合的外源片段长度可以增加，而且表达的融合蛋白的水溶性也可提高，有利于融合蛋白的纯化和应用。本专利技术选用包含HCV核心抗原主要抗原决定簇的氨端69个氨基酸或40个氨基酸作为被融合片段，在不影响HCV核心蛋白的抗原性和免疫原性的基础上，尽量缩短被融合片段的长度而使融合蛋白在大肠杆菌中的表达量提高，而且水溶性不受影响。本专利技术得到的这一新型双重抗原，它包含HBcAg和HCV核心蛋白的主要抗原决定簇部位，且能自发装配成颗粒，从而大大提高HCV核心蛋白的免疫原性，可以应用于乙肝和丙肝的检测，发展为乙肝和丙肝的预防和治疗疫苗，具有较广的应用范围和较高的应用价值。本专利技术利用基因重组技术，在HBcAg(全长共183个氨基酸)基因中原先就含有的两个BspMII酶切点，用限制性内切酶BspMII局部酶解，选择单切开处于精氨酸富集区前第144位的BspMII切点，然后在去除了羧端富含精氨酸区后的相对应于羧端第144位氨基酸的位置上引入一个EcoRI酶切位点，构建了一个可在HBcAg的第144位氨基酸处与任何能对齐阅读框架的外源基因片段融合的通用融合载体pBc144E(见图1)。然后通过基因重组技术将HCV核心蛋白(全长共191个氨基酸)基因融合于构建的通用融合载体上的EcoRI位点后，得到HBcAg(氨基酸1-144)基因与HCV核心蛋白(氨基酸1-191)全基因的融合重组质粒pBc144Cc191(见图2)。在其基础上通过在HCV核心蛋白基因上对应于第69位氨基酸处的StyI位点或对应于第40位氨基酸处的ApaI位点经相应酶解后，再补平，回联得到羧端已缩短的融合克隆，即HBcAg(氨基酸1-144)基因与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)基因的融合克隆得含融合基因的重组表达质粒pBc144Cc69或pBc144Cc49(见图3)，其中重组表达质粒pBc144Cc69转入大肠杆菌TG-1中存放(由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，1997年4月14日，保藏编号为CGMCC No0302。)，该大肠杆菌经过表达，得到具有颗粒形状，为水溶性，并具有双重抗原性和良好的免疫原性的融合蛋白Bc144Cc69和Bc144Cc40。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)表明，表达的融合蛋白Bc144Cc69和Bc144Cc40都同时具有乙肝病毒核心抗原和丙肝病毒核心蛋白的双重抗原性。通过蛋白质印迹反应(Western Blot)的鉴定表明，融合蛋白Bc144Cc69和Bc144cc40既能与乙肝病毒核心抗原的抗体杂交反应，同时又能与丙肝病毒核心蛋白的抗体杂交反应(见图4)。这说明获得的该融合蛋白为水溶性良好的具有乙肝核心抗原和丙肝核心蛋白双重抗原性的融合抗原。另外，通过CsCl密度梯度超离心分析表明，Bc144Cc69具有1.31克/毫升和1.35克/毫升的密度峰，Bc144Cc40具有1.28克/毫升的密度峰(见图5)。通过电子显微镜直接观察表明(见图6)，经过初步纯化的该融合抗原能形成直径约为27nm的颗粒，颗粒形状与报道的HBcAg颗粒(Cohen，B.J.等，Nature，1982，296677)相似。该融合抗原免疫BALB/C小鼠能同时产生高滴度的抗HBcAg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时含有乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒核心抗原的双重抗原，其特征在于该双重抗原是通过融合基因表达获得的具有双重抗原性的融合蛋白，所述融合基因是乙肝病毒核心抗原中去除羧端精氨酸富集区后对应于１－１４４位氨基酸的主要抗原决定簇基因与丙肝病毒核心蛋白１至６９位氨基酸或１至４０位氨基酸的主要抗原决定簇基因的融合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李光地，杨莉，汪垣，
申请(专利权)人：中国科学院上海生物化学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]