一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒及检测方法。包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原Ｅ２的多克隆抗体，酶标孔板，生物素标记单链ＤＮＡ适配子ＺＥ１８，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物。将抗丙型肝炎病毒包膜抗原Ｅ２的多克隆抗体包被酶标孔板，加入丙型肝炎病毒或待检血清或血液样品以及对照样品，经洗涤六次，结合在板上的丙型肝炎病毒或包膜抗原Ｅ２再用生物素标记的适配子ＺＥ１８捕获，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，加入底物显色，显色终止后，在酶标仪的吸收波长上测其ＯＤ值。本试剂盒检测速度快，操作方便安全，省时效率高，有效地对丙型肝炎病毒进行检测。试剂盒价格低廉，检测灵敏度和精确度很高，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于感染性疾病检测
具体涉及到一种丙型肝炎病毒及其表面包 膜抗原E2的试剂盒，同时还涉及一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2试剂盒的检测方 法，它适用于丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒抗原的检测。
技术介绍
丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus, HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌 (HCC)，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎呈全 球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV 的感染率约为3%，估计约1. 7亿人感染了 HCV，每年新发丙型肝炎病例约3. 5万例。丙型 肝炎目前尚无有效疫苗，也没有有效的治愈方法。因此，控制丙型肝炎只能从传染源和传播 途径入手，早期准确诊断和发现HCV感染者就是防控丙型肝炎传染源、阻断传播途径最为 有效的手段。所以，世界各国都不遗余力的研究丙型肝炎的诊断新技术。自从1989年建立了丙肝病毒抗-HCV检测方法以来，丙型肝炎的检测技术就处于 不断发展中。到目前为止，丙型肝炎检测技术主要有抗-HCV检测、HCV-RNA核酸扩增检测、 和HCV核心抗原的检测。目前用于临床HCV感染检测的主要指标仅为抗HCV和HCV-RNA，但 两者在丙肝诊断中均存在一定的局限性，如对于免疫功能不正常、或“窗口期”的HCV感染 者，则不能检出抗-HCV，有一定的漏检率；HCV RNA其操作复杂，而且仪器特殊、检测费用昂 贵，在一般实验室不易开展。作为HCV感染的检测手段，HCV表面抗原检测丙型肝炎病毒的 感染具有十分重要的意义。
技术实现思路
专利技术的目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒，该 试剂可以检测丙型肝炎病毒的感染，检测速度快，操作方便安全，省时效率高，而且价格低 廉，检测灵敏度和精确度都很高，应用前景广阔。专利技术的另一个目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂 盒检测丙型肝炎病毒的方法，该试剂盒优于HCV抗体检测法，本方法可以检测窗口期，即病 毒感染的早期或潜伏期，有利于早期对病人的防治；另外在成本和操作上也优于HCV-RNA 核酸扩增检测法，比HCV-RNA核酸扩增检测法成本低，操作更简便，检测灵敏度和精确度 高。本专利技术试剂盒对丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2检测的方法是利用一种能特异性 结丙型肝炎病毒表面包膜抗原E2的单链DNA适配子作为探针，采用丙型肝炎病毒及其表面 包膜抗原E2多克隆抗体包被孔板，生物素标记的该DNA适配子作为探针，类似夹心ELISA 法，用于检测血清或体液中丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施—种丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素 标记核酸适配子ZE18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公 司)及其显色底物3’，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(购自深圳达科为生物技术有限公 司)。所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体(或抗血清)的制备将 丙型肝炎病毒包膜抗原E2的真核表达载体pcDNA3. 1A-E2 (来源于Vaccine，2007，25 1544-1551)，肌肉多点注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫注射100 200微克质 粒DNA，注射三次，用基因电导入仪(购自宁波新芝生物科技有限公司)在注射部位电极 导入DNA，第三次注射后2周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重组蛋自(来源于Vaccine， 2007,25 :1544-1551)加强免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100微克蛋白，两周后心脏取 血，IOOOrpm离心分离血清，即为丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体(或抗血清)。保 存于-80°C。所述的核酸适配子观18为本专利技术者通过SELEX筛选技术，通过筛选到的能特异性 结合丙型肝炎病毒包膜抗原E2的单链DNA适配子，命名为观18(具体步骤见专利技术专利申 请号:200810197315. 4，专利技术人章晓联，陈芳)。所述的生物素标记核酸适配子观18 将观18序列送公司合成，公司合成生物素标 记观18的5，端(命名为bio-ZE18)。并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，_20°C保存。 新型生物素标记的DNA适配子具有SEQIDN0. 1，所示的核苷酸序列；一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，检测步骤是1、将1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效价为1 12800， PBS稀释)包被酶标板(如96孔)，4度过夜。2、含有 5/10000 吐温-20 的磷酸盐缓冲液(PBS 溶液=NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去离子水溶解，定容至IOOOml，调pH至7. 4，15磅灭菌20min,置4°C 保存)，洗涤六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封闭96孔板，100 μ 1/孔，37度封 闭1小时。4、加入待检样品、包括HCV病毒(来源于Cell Mol Immunol. 2009,6(4) :235-44)、 HCV病毒阳性血清、或对照样品，100 μ 1/孔，37度孵育1小时。5、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。6、加入 bio4E18G00nM/孔，PBS 稀释)，37 度孵育 1 小时。7、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。8、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀释)，100 μ 1/孔，37度孵育1小时。9、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。10、加入底物显色剂(TMB) (TMB干粉10mg，溶于5ml无水乙醇中Qmg/ml)。pH5. 0 显色液IOml中，加入ang/ml TMB 0.5ml，再加入2μ1 30% H2O2，临用前配制)显色2min， 用2M浓硫酸中止显色。本专利技术中所用的底物显色剂配方包括A底物是TMB 20mg(固体)， 先用无水乙醇IOml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到100ml，此即是A底物；B底物是取1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 6細1，双 蒸水定容至100ml (无须调pH值，应在4. 5-5. 0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B 底物各取5ml混勻。11、1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸 光度。检测结果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒E2抗原或HCV感染阳性病人及其丙型肝炎 病毒E2抗原阳性病人的0D450值均大于设定的临界值(cutoff值)，而阴性样品或正常健 康人的0D450值均小于临界值(cutoff值)，cutoff值=0. 1 X阳性对照的平均0D450值 +阴性对照的平均0D450值。说本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括：抗丙型肝炎病毒包膜抗原Ｅ２的多克隆抗体；酶标板；生物素标记核酸适配子ＺＥ１８；辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物３’，３’，５，５’－四甲基联苯胺；所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原Ｅ２的多克隆抗体的制备：将丙型肝炎病毒包膜抗原Ｅ２的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１Ａ－Ｅ２，肌肉多点注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫注射２００ｇ质粒ＤＮＡ，注射三次，用基因电导入仪在注射部位电极导入ＤＮＡ，第三次注射后２周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原Ｅ２重组蛋白加强免疫，免疫注射２次，每次免疫注射１００μｇ蛋白，两周后心脏取血，１０００ｒｐｍ离心分离血清，为丙型肝炎病毒包膜抗原Ｅ２的多克隆抗体，保存于－８０℃；所述的生物素标记核酸适配子ＺＥ１８：将ＺＥ１８序列合成，合成生物素标记ＺＥ１８的５’端为：ｂｉｏ－ＺＥ１８，用无菌双蒸水稀释为４００ｎＭ的浓度，－２０℃保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：章晓联，胡艺兰，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[]