抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的制备方法技术

抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： （１）乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的分离； （２）乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的体外培养； （３）乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞培养增殖后Ｂ细胞和Ｔ细胞的分离； （４）用ＳＣＩＤ鼠体内培养乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞； （５）收集含表达乙肝表面抗体的人Ｂ细胞，与人骨髓瘤细胞ＳＰ２或小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１、ＳＰ２／０融合； （６）选择性培养基培养筛选杂交细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩增与冻存，单克隆抗体性质的鉴定； （７）培养杂交瘤细胞； （８）收集细胞培养上清，用亲和层析柱纯化上清中的抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，更确切地说是利用细胞程和抗体工程技术，获得分泌抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体的人-鼠杂交瘤和人-人杂交瘤细胞系，并通过杂交瘤细胞的多孔微载体培养，及采用亲和层析方法纯化细胞培养上清，制备可用于乙型肝炎的预防和治疗的抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体的方法，属于生物工程
抗体被动免疫能够有效地预防和治疗病毒感染，从anti-HBsAg阳性的人血浆中提取的乙肝免疫球蛋白(Hepatitis B Immune Globulin，HBIG)Nabi-HBTM已经在1999年获得FDA批准用于预防和治疗乙肝。我国也有类似的产品上市，如深圳市卫武光明生物制品有限公司生产的人乙型肝炎免疫球蛋白(批准文号国药准字SF20010049，国药准字SF20010050)。人Anti-HBsAg抗体能够中和血液循环中的乙肝病毒，大大减小血液中的病毒颗粒数和HBV DNA，以减轻症状。也可与其他抗病毒药物如干扰素、拉夫米定等联合使用，以增强疗效。这些治疗方法正处于临床实验中。但是，由于乙肝免疫球蛋白从人血浆中提取，虽经过严格的灭毒提纯工艺，但仍存在传播传染性疾病的危险，并且来源有限价格昂贵，因而大大限制了其在临床中的应用。利用基因工程、抗体工程和细胞工程等生物技术，开发基因工程或抗体工程的人Anti-HBsAg抗体以取代目前的乙肝免疫球蛋白，将会大大促进乙型肝炎的防治。鼠源单抗由于存在半衰期短、Fc段与人体细胞的FcR结合能力差以及反复使用可使人体产生人抗鼠抗体(HAMA)引起过敏反应等原因，限制了鼠源单抗在疾病治疗中的应用。治疗用抗体药物开发的最主要的障碍是如何获得人源抗体。目前批准用于临床治疗的单抗药物都是基于鼠源单抗，通过基因工程手段改造而获得的。鼠源抗体的人源化极大地促进了抗体药物开发的进展，但也有一些不足，如(1)技术路线较复杂，开发的难度大、周期长；(2)在人源化过程中，抗体与抗原的亲和能力可能会大大下降，从而影响其治疗效果；(3)由于人源化抗体中还包含部分鼠源序列，在使用过程中仍有部分病人会产生人抗嵌合抗体抗体(HACA)。从理论上说利用杂交瘤技术制备人—人杂交瘤细胞是生产人源单克隆抗体最理想的方法，但是难度很大，主要问题有(1)缺乏理想的亲本人骨髓瘤细胞株。许多人骨髓瘤细胞自身分泌抗体，且融合后不稳定。(2)难于获得大量的抗原特异性人B淋巴细胞。(3)人单克隆抗体的大量生产问题。由于免疫排斥，人杂交瘤细胞不能在小鼠或其他动物体内生长，在裸鼠体内生长的效果也很不理想。比较理想的方法是利用生物反应器大规模高密度培养人杂交瘤细胞。因此，尽管抗体药物在许多领域表现出较好的治疗效果，但至今还没有一种利用杂交瘤技术生产的人源(而非人源化)单克隆抗体药物问世。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案，该方法包括以下步骤(1)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的分离先用0.1％的甲基纤维素生理盐水溶液初步沉降乙肝表面抗体阳性的健康人外周血中的红细胞，再利用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque，d＝1.077)分离其中的单个核细胞。获得的细胞中包含分泌乙肝抗体的B细胞及可以在SCID鼠体内形成类似于人体免疫系统的一些造血干细胞。(2)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的的体外培养通过体外混合培养外周血单个核细胞以活化、致敏和增殖其中的HBsAg特异的B细胞。(3)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞培养增殖后B细胞和T细胞的分离采用植物凝聚素等方法，去除混合培养外周血单个核细胞中的T细胞，以获得分泌anti-HBsAg滴度较高并且相对较纯的人B细胞供细胞融合使用。(4)用SCID鼠体内培养乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞；也可通过将人外周血单个核细胞移植到SCID小鼠体内，来活化、致敏和增殖其中的HBsAg特异的B细胞，经过一段时间收集SCID小鼠的脾细胞做细胞融合。(5)收集含表达乙肝表面抗体的人B细胞，与人骨髓瘤细胞SP2或小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0融合将体外混合培养或SCID小鼠体内培养获得的可分泌抗HBsAg抗体的的人B细胞与人骨髓瘤细胞SP2或小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0融合。(6)选择性培养基培养筛选杂交细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩增与冻存，单克隆抗体性质的鉴定，获得分泌抗乙肝表面抗原的单克隆抗体的人-人杂交瘤或人-鼠杂交瘤细胞系。(7)培养杂交瘤细胞，获得大量的含抗乙肝表面抗原的单克隆抗体的培养上清。(8)收集细胞培养上清，用亲和层析柱纯化上清中的抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体。本专利技术的优点是(1)安全性好。用本方法生产乙肝表面抗体，不需要从乙肝表面抗体阳性人血中提取，从而避免了血液制品中可能污染其他致病原如丙肝、HIV等而导致用药者感染这些疾病的可能性。(2)来源方便。目前生产的乙肝免疫球蛋白是从乙肝表面抗体阳性人血中提取，原料来源非常有限，并且价格昂贵，采用本专利技术中可分泌乙肝表面抗体的杂交瘤细胞的大规模培养技术可以无限制大量生产乙肝表面抗体，并且随着生产规模的扩大可以大大降低生产成本。(3)产品质量可控性好。由于细胞的背景、细胞培养基的成分以及细胞培养上清的纯化都是明确可控的，用这种方法生产出的单克隆抗体的质量具有很强的可控性和可重复性，而血液来源的乙肝免疫球蛋白，由于人血成分的复杂及其不同捐血者的个体差异，其产品质量容易受到不同批次血液原料的影响。(4)可节约大量宝贵的血液资源。二、体外培养获得供细胞融合的可分泌抗HBsAg抗体的的人B细胞1、乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的体外培养将第步骤一获得的单个核细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)的培养基将细胞配成1×106/ml浓度，用细胞培养瓶培养，培养基中添加适量的细胞因子如IL-2、IL-4和(或)IL-6，～0.1μg/ml乙肝表面抗原，适量的可促进淋巴细胞分裂的植物凝聚素如商陆促有丝细胞分裂原，2-巯基乙醇5×10-5mol/mL，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。2、单个核细胞中的T细胞删除经过7天体外培养，收集培养的单个核细胞，将细胞用PBS配成4×108/mL，取0.5mL细胞悬液与0.5mL 2mg/mL的大豆凝聚素混合，室温反应5～10min，使B细胞凝聚。在15mL离心管中加入10mL2％BSA溶液，垂直放置离心管，将上述细胞悬液慢慢加至BSA溶液上面，令细胞自然沉降，凝聚的B细胞可在10～15min内沉降至管底，而未凝聚的T细胞则在BSA溶液上部，吸出未凝聚细胞，收集沉降的B细胞，用D-半乳糖溶液解聚，便可获得纯度较高的单个B细胞。三、SCID鼠体内培养获得供细胞融合的可分泌抗HBsAg抗体的的人B细胞将步骤一获得的单个核细胞用DMEM/F12(1∶1)的培养基将细胞配成1～2×108/ml的细胞悬液，经尾静脉或腹腔注射到8～11周的SCID小鼠体内，每只小鼠注射的人单个核细胞数为5×107～1×108，5μg含Al(OH)3佐剂的乙肝疫苗。也可事先将SCID小鼠用2.5Gy的γ射线照射，再移植人单个核细胞。将SCID鼠置于SPF等级的动物房中饲养。14天后取小鼠眼球血一滴，用ELI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡显文，高丽华，陈惠鹏，胥照平，李世崇，陈昭烈，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：