稳定高表达疫苗用乙肝病毒表面抗原的转基因CHO细胞株制造技术

本发明专利技术是一种ＣＨＯ细胞株，其能稳定高效表达疫苗用ＨＢＶ表面抗原。通过对已经能够表达抗乙肝病毒表面抗原的ＣＨＯ细胞株进行孔板筛选及基因扩增筛选的方法，获得了稳定高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的ＣＨＯ细胞株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种稳定高表达疫苗用乙型肝炎病毒表面抗原(H邻atitis B surface antigen, HBsAg)的CHO细胞株。技术背景.-乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒，而乙型肝炎病毒感染是一个 世界性的公共卫生问题，在我国乙肝的感染率约60%，乙肝表面抗原的携 带率约10%，每年约有30万人最终将死于乙肝有关的慢性疾病，是传染 病死亡第一位。乙型肝炎病毒的包膜蛋白称为HBsAg，是决定病毒吸附至易感细胞受 体的成分，编码包膜蛋白的基因可分为S、 Pre-Sl和Pre-S2 (传统上HBsAg 常指由S基因编码的蛋白)，包膜蛋白由三种蛋白组成1、 小蛋白(S蛋白)，由S基因编码。2、 中蛋白(M蛋白)，由S及Pre-S2基因区编码。3、 大蛋白(L蛋白)，由S、 Pre-Sl及Pre-S2基因区编码。HBV感染者血清中有3种不同形态的病毒颗粒小球形颗粒(直径22nm〉、 管状颗粒(直径22nm、长度100-1000nm) 、 Dane颗粒，不存在单独的前 Sl蛋白或前S2蛋白。小蛋白(S)、中蛋白(M)以及大蛋白(L)这3种蛋白在不同颗粒 表面存在的情况不同，乙肝感染者中，在感染者的病人血流中最大多数为 22nm的小球颗粒，仅由小蛋白或同时有约5%的中蛋白组成；病毒复制期 病人同时有少数长短不一、直径22nm的管型颗粒，由小蛋白、2%-5%中 蛋白和5%-10%大蛋白组成。在病毒非复制期，大蛋白在血清中很低或无， 大量滞留在肝细胞中。因此可以根据检测血液中大蛋白的有无，来判断病 毒携带者肝内的HBV病毒是否在进行复制。表达构件进入细胞后一般随机插入到基因组DNA中，目标基因的表 达水平会因不同的插入位点而有极大差异。为了得到一个比较理想的稳定 表达细胞株往往需要费时费力的大量筛选工作。乙型肝炎(乙肝)治疗可分为两大类 一类为抗病毒治疗。抗病毒治疗 主要是a干扰素(IFNa)和核苷类药物，但疗效不甚满意。另一类为免疫治 疗，主要是宿主针对受病毒感染肝细胞的免疫反应和引起炎症的细胞因子 介导的，免疫治疗可以打破免疫耐受状态，诱导有效的机体免疫，抑制并 清除病毒，因此，接种乙肝疫苗是控制乙肝最有效的措施之一。目前，国际上应用的乙型肝炎疫苗主要是用酵母或CHO细胞表达的S 蛋白作为预防疫苗。重组(酵母)乙肝疫苗是目前国内外应用的主要品种， 重组酵母乙肝疫苗为单一抗原；巴斯德的重组(CHO)乙肝疫苗含有PreS2 和S抗原；中国预防医学科学院病毒所研制的CHO细胞中表达了含有S 和PreSl基因的乙肝表面抗原。重组CHO细胞乙肝疫苗，自投产以来， 一直供不应求，但一直存在表 达量低、成本高的难题。国内疫苗生产因细胞株表达量太低， 一般小于 5mg/L，导致产量低、成本高居不下。目前，在国内的研究还主要停留在 如何利用CHO细胞制造乙肝疫苗，还没有上升到稳定高表达细胞株的筛选 领域的研究。ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫 酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用 于生物学和医学科学的许多领域。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底 物的髙效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、 抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一 种试剂孵育后，可通过洗漆除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的 特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有 多种。用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检 测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹 心法及EUSA间接法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述
技术介绍
存在的不足，筛选出一种具有高效表达疫苗用乙肝病毒表面抗原的CHO细胞株。本专利技术的目的按下述方案实现 一种疫苗用乙肝病毒表面抗原的CHO细胞株经孔板筛选及基因扩增方法首次获得了其稳定表达的CHO细胞株。 本专利技术对上述细胞株产物的特异性及产物产量进行了鉴定。对上述细胞 株的生物学特性采用ELISA方法。具体实施例方式一、 高表达株的选择1. 利用孔板筛选出有活的抗性细胞克隆的孔。2. 用ELISA分析其上清全S基因蛋白的浓度。3. 将表达量高的细胞转入孔板中培养。4. 用ELISA方法分析全S基因蛋白的上清。5. 保留表达目的抗体的浓度达到要求的克隆。二、 基因扩增1. 在摇动培养瓶中接种细胞。2. 在有筛选压力的培养基中培养细胞。3. 当细胞密度达到密度时，收集培养基用于EUSA分析。4. 除去那些随压力扩大化而并不能增加产量的克隆。5. 重复扩增循环直到产量到达期望点。三、 制备主细胞库1. 每次孔板筛选出表达量较高的细胞株时，对细胞进行计数，冻存 密度为5xl(^个活细lfi/ml， -80°(:过夜，然后转至液氮中保存。2. 在摇瓶中筛选出表达量较高的细胞株时，冻存细胞，与孔板筛选 冻存条件一致。3. 在细胞入库前对细胞进行支原体污染的检验。权利要求1、一种稳定高效表达疫苗用乙型肝炎病毒表面抗原的CHO细胞株。全文摘要本专利技术是一种CHO细胞株，其能稳定高效表达疫苗用HBV表面抗原。通过对已经能够表达抗乙肝病毒表面抗原的CHO细胞株进行孔板筛选及基因扩增筛选的方法，获得了稳定高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的CHO细胞株。文档编号C07K14/02GK101302496SQ20071010711公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月8日 优先权日2007年5月8日专利技术者刘逸人, 李荣皓, 颖 王, 磊 石, 姝 韩, 峰 高, 黎志良 申请人:中美奥达生物技术(北京)有限公司;北京涌泉万方生物技术有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定高效表达疫苗用乙型肝炎病毒表面抗原的ＣＨＯ细胞株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣皓，高峰，黎志良，王颖，韩姝，刘逸人，石磊，
申请(专利权)人：中美奥达生物技术北京有限公司，北京涌泉万方生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[]