SARS病毒抗原的细胞表面表达载体和用该载体转化的微生物制造技术

本发明专利技术涉及一种ＳＡＲＳ冠状病毒抗原的表面表达载体，该载体包括一种编码诱导ＳＡＲＳ的冠状病毒的抗原的基因，以及一种或两种或多种编码聚－γ－谷氨酸合成酶复合物的ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ和ｐｇｓＡ基因，还涉及被表面表达载体转化的微生物以及包括该微生物的ＳＡＲＳ疫苗。本发明专利技术使得采用表达ＳＡＲＳ冠状病毒抗原的重组菌株来经济地制备预防和治疗ＳＡＲＳ的疫苗成为可能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种在微生物表面表达SARS抗原的载体，由该载体转化的微生物，以及用于预防SARS的疫苗，该疫苗包括转化的微生物或其提取物以及纯化的物质。更具体而言，本专利技术涉及一种表面表达载体，其包括一种编码诱导SARS的冠状病毒的抗原蛋白的基因，以及一种或两种或多种编码微生物表面锚定序列(anchoring motif)的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsB，pgsC和pgsA基因，还涉及被该载体转化的微生物以及包括该转化微生物作为有效成分的SARS疫苗。
技术介绍
严重急性呼吸性综合征(SARS)是一种新型的流行性疾病，自从2002年11月在中国广东省首次开始爆发，其已遍布全球，包括香港、新加坡、加拿大(多伦多)等地区。该流行病表现出呼吸性症状，如发烧38℃或更高、咳嗽、呼吸困难、非典型性肺炎。SARS的作用物就是变异性致病冠状病毒。通常，冠状病毒家族成员是具有(+)RNA的很大的RNA病毒。染色体由约29,000至31,000碱基对组成，显微镜下可观察到该病毒呈冠状。能引起人类上呼吸道疾病，引起动物的呼吸系统、肝脏、神经和肠道疾病。自然界中存在三组冠状病毒，其中组I和组II感染哺乳动物，组III感染鸟类。已知的冠状病毒有时会引起免疫体系能力较弱的人类发生与肺部有关的疾病，或引起动物如狗、猫、猪、鼠、鸟等的严重疾病。冠状病毒突变率很高，重组率高达约25％。推测这些特点导致原始冠状病毒发生变异，而形成新型的突变的冠状病毒(SARS冠状病毒)，该病毒从动物传播至人类。根据世界卫生组织(WHO)的统计，自2002年11月起，31个国家中有7,447名SARS疑似患者，其中有551名死亡。2003年的SARS感染危险区域包括中国的北京、广东、香港、内蒙古、山西和天津，新加坡、加拿大的多伦多、台湾、蒙古的乌兰巴托、菲律宾等。然而，还有传播到全世界的风险。自从2002开始爆发以来，关于SARS冠状病毒，德国热带医学的研究所首先对SARS病毒的核苷酸序列进行破译。该研究小组通过PCR(聚合酶链式反应)破译了一部分基因的核苷酸序列。破译结果提供给了一家德国生物工程公司Artus GmbH，用来开发检测SARS病毒感染的试剂盒。该试剂盒通过将SARS疑似患者体内的病毒基因扩增来检测出SARS的感染。之后，到目前SARS病毒的全基因组已被破译，已完全分析了超过12个分离出的毒株的序列。首先被分离出的Urbani株的全部序列是美国CDC研究小组破译的。加拿大大不列颠哥伦比亚癌症研究中心(Canada British Columbia Cancer search center)小组分析了2003年4月12日从加拿大多伦多一名患者体内分离出的SARSTor2病毒株的全部序列(Marra，M.A.，Science 1085953，2003；GenBankAccession 274119)。尽管这两个研究小组分析了不同地区SARS感染者体内分离出的冠状病毒，但这两种病毒显示出的区别仅是15个碱基对的不同。这暗示了SARS是从同一病毒被诱导产生的。还有，根据SARS冠状病毒的基因分析结果，可以看出SARS冠状病毒的蛋白质组成与现存冠状病毒的蛋白质组成相同，但基因组以及基因组编码的氨基酸同源性却很低。鼠肝炎病毒和火鸡支气管病毒都与SARS冠状病毒有相似性。但是，分子分类学分析提供了SARS冠状病毒与其它冠状病毒的相关性，结果说明SARS冠状病毒与现存的组不同。目前，SARS冠状病毒的鉴定始于PCR，抗体检测的阳性结果是由ELISA或IFA所确定的。病毒的分离是通过对PCR鉴定的患者进行细胞培养检测，以确定SARS冠状病毒的感染。目前还没有治疗SARS的基本方法，只有辅助治疗。对SARS冠状病毒这种新的流行病的作用物的研究才刚刚起步，还没有开发出预防SARS的疫苗。世界各地已开始了开发预防SARS的疫苗的多方面研究。在微生物的细胞表面上附着并表达所需蛋白的技术被称作细胞表面展示技术(cell surface display technology)。细胞表面展示技术采用微生物如细菌或酵母菌的表面蛋白作为表面锚定序列而在表面上表达外源蛋白，这种技术的应用范围包括重组活疫苗的制备、肽/抗体库的构建以及筛选、全细胞的吸附、全细胞的生物转化催化剂等。该技术的应用范围由细胞表面上表达的蛋白质所决定。因此，细胞表面展示技术具有巨大的工业应用潜力。对于连续的细胞表面展示技术，表面锚定序列是至关重要的。本技术的核心是选择并开发出能在细胞表面有效表达外源蛋白的结构。因此，为了选择表面锚定序列，应考虑以下特征(1)它应该具有分泌信号来帮助外源蛋白通过细胞内膜，从而使外源蛋白能转运至细胞表面上。(2)它应具有靶信号来帮助外源蛋白稳定地固定到细胞外膜的表面上。(3)它可在细胞表面上大量地被表达，而不影响细胞的生长。(4)它与蛋白的大小无关，且能表达外源蛋白而不会改变蛋白的三维结构。然而，还没有开发出满足上述条件的表面锚定序列。已知的和目前使用的表面锚定序列通常分为四种类型的细胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白、表面器官蛋白如鞭毛蛋白。在革兰氏阴性菌中，已经使用了细胞外膜蛋白，诸如LamB、PhoE(Charbit et al.，J.Immunol.，1391658，1987；Agterberg et al.，Vaccine，885，1990)、OmpA等。采用的脂蛋白有诸如TraT(Felici et al.，J.Mol.Biol.，222301，1991)、PAL(与脂蛋白有关的肽聚糖)(Fuchsetal.，Bio/Technology，91369，1991)以及Lpp(Francisco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4892713，1992)。作为表面锚定序列来表达外源蛋白的有黏着在1型菌毛上的菌毛蛋白(fimbriae protein)，如FimA或FimH(Hedegaard etal.，Gene，85115，1989)，以及菌毛蛋白(pili protein)如PapA pilu亚单位。此外，还有报道能作为表面锚定序列的包括冰核蛋白(ice nucleation protein)(Jungetal.，Nat.Biotechnol.，16576，1998；Jung et al.，Enzyme Microb.Technol.，22348，1998；Lee etal.，Nat.Biotechnol.，18645，2000)，Klebsiela oxytoca的支链淀粉酶(Komacker et al.，Mol.Microl.，41101，1990)、Neiseria的IgA蛋白酶(Klauser et al.，EMBO J.，91991，1990)、附着在大肠杆菌上的AIDA-1、志贺菌属的VirG蛋白，以及Lpp和OmpA的融合蛋白。据报道，在使用革兰氏阳性菌的情况下，可利用金黄色葡萄球菌中的蛋白A和FnBPB蛋白为表面锚定序列、利用乳酸菌的表面壳蛋白进行表面表达、利用革兰氏阳性菌的表面蛋白如化脓性葡萄球菌遗传因子(Staphylococcus pyogenes)的M6蛋白(Medaglini，D et al本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表面表达载体，其包括编码聚－γ－谷氨酸合成酶复合物的ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ和ｐｇｓＡ基因中的任意一种或两种或多种，以及一种编码ＳＡＲＳ冠状病毒的刺突抗原蛋白或核壳抗原蛋白的基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：成文喜，金哲仲，郑昌敏，洪承杓，李宗洙，催在哲，金光，黑田俊一，夫夏玲，
申请(专利权)人：生物领先公司，MD实验室，生物领先日本公司，韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]