利用源自干酪乳杆菌的两种启动子共表达两种靶蛋白的表面表达载体以及使用其在微生物表面上表达蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用源自乳杆菌的两种启动子能够在微生物表面上共表达两种不同的靶蛋白的载体和使用该载体在微生物表面上表达靶蛋白的方法。将包含插入其中的外源基因的载体转化到微生物中，并使不同的外源蛋白在该微生物的表面上稳定地表达。此外，本发明专利技术涉及一种包含编码聚‑γ‑谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA的表面表达载体以及使用该载体在微生物表面上表达靶蛋白的方法。将包含插入其中的外源基因的载体转化到微生物中，并使外源蛋白在该微生物的表面上稳定地表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用源自干酪乳杆菌的两种启动子共表达两种靶蛋白的表面表达载体以及使用其在微生物表面上表达蛋白质的方法
本专利技术涉及一种使用源自干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子在微生物表面上共表达两种不同基因的载体，以及用该载体转化的微生物。此外，本专利技术涉及一种新载体，该载体使用源自芽孢杆菌(Bacillussp.)菌株并参与聚γ-谷氨酸合成的外膜蛋白(pgsA)在微生物表面上有效地表达外源蛋白。此外，本专利技术涉及一种通过使用源自芽孢杆菌菌株并参与聚γ-谷氨酸合成的外膜蛋白(pgsA)在微生物表面上表达外源蛋白来制备蛋白质的方法。
技术介绍
细胞表面展示或细胞表面表达是指一种将蛋白质或肽与适当的表面锚定基序融合并且表达在革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌、真菌、酵母或动物细胞的表面上的技术(LeeS.Y.，等人，TrendsBiotechnol.，21：4552，2003)。首次细胞表面展示技术是使用具有相对简单的表面的噬菌体于20世纪80年代开发的，并且是一种将肽或小蛋白质与丝状噬菌体的pIII融合并表达的技术。因此，首次细胞表面展示技术被称为表面表达系统。使用噬菌体的细胞表面展示已经用于筛选抗体、表位和高亲和力配体，但是由于能够在噬菌体表面上展示的蛋白质的大小相对有限而具有局限性。因此，作为其替代，已经开发了使用细菌的细胞表面表达。这种细胞表面展示是通过使用诸如细菌或酵母的微生物的表面蛋白质作为表面锚定基序而在微生物表面上稳定地表达外源蛋白质的技术。为了利用特定生物体的外膜蛋白在细胞表面上表达外源蛋白，应当在基因水平上将合适的表面蛋白和外源蛋白相互连接以形成融合蛋白，并且该融合蛋白应当稳定地穿过细胞内膜，并且应当附着和保持在细胞表面上。为此，优选使用具有以下特性的蛋白质作为表面锚定基序。即，(1)该蛋白质在N末端具有能够穿过细胞内膜的分泌信号；(2)该蛋白质应当具有能够稳定地附着到细胞外膜上的靶向信号；(3)该蛋白质能够在不负面影响细胞生长的范围内大量表达在细胞表面上，以使该蛋白质能够表现出高活性；(4)该蛋白质应当能够能稳定地表达而与其大小无关，以便可以用于各种反应中(Georgiou等人，TIBTECH，11：6，1993)。此外，也需要对这种表面锚定基序进行基因工程，以便将其插入宿主细胞表面上的外膜蛋白的N末端、C末端或中央部分中(Lee等人，TIBTECH，21：45-52，2003)。为了在细菌表面上表达蛋白质，该蛋白质应当在其一级序列中具有能够使在细胞中生物合成的蛋白质穿过细胞膜的分泌信号。此外，在革兰氏阴性细菌的情况下，蛋白质应当穿过细胞内膜和细胞膜间隙，应当插入并附着到细胞外膜上，并且应当锚定到膜上，以便伸出膜外。在细菌情况下，用于将蛋白质锚定到细胞表面上的具有这种分泌信号和靶向信号的蛋白质的实例包括表面蛋白质、特定酶和毒素蛋白质。事实上，如果将这些蛋白质的分泌信号和靶向信号与适当的启动子一起使用，这些蛋白质就可以成功地表达在细菌表面上。同时，在乳酸菌中产生有用的外源蛋白的尝试主要通过使用可诱导的启动子作为诱导剂或通过确保高效率的启动子来进行。尽管对表达如上所述的靶蛋白的乳酸菌积极地进行了各种应用的开发和学术研究，但是仍然存在的问题在于靶蛋白的表达水平不足，以及当使用可诱导的表达启动子获得的蛋白质在体内施用时，可能该蛋白质不能持续表达。近年来，在美国和欧洲，对使用乳酸菌开发活疫苗、用于将有用的激素药物递送至肠道内并为此建立有效的遗传资源的载体、以及开发用于乳酸菌的插入载体进行了研究。特别地，由于在乳酸菌中含有大量的未甲基化的CpGDNA、脂磷壁酸、肽聚糖等已知作为免疫佐剂，因此乳酸菌被认为是非常有用的疫苗载体。此外，由于对胆酸和胃酸具有抗性而可以将抗原递送至肠道中，并因此在肠道内诱导粘膜免疫，因此乳酸菌具有很多优势。然而，为了使用乳酸菌作为疫苗载体，需要开发一种通过将产生预防疾病的抗体的抗原蛋白呈递至细胞内部或外部来促进抗原-抗体反应的技术。同时，已知半乳糖变旋酶在作为D-半乳糖分解代谢的代谢途径Leloir途径中通过将β-D-半乳糖催化转化为α-D-半乳糖而在正常的半乳糖代谢中发挥重要作用。然而，对在乳酸菌中这种半乳糖变旋酶的分子生物学特性的研究仍然是不足的。因此，本专利技术人利用在其细胞表面上表达HPVE7蛋白的菌株开发了在微生物表面上有效表达两种不同外源蛋白质的表面表达载体，以及在微生物表面上稳定地表达大量的两种不同外源蛋白质的方法。此外，本专利技术人对使用参与聚γ-谷氨酸合成的基因(pgsA)作为新的表面锚定基序进行了广泛的研究，并因此开发了一种使用pgsA基因在微生物表面上有效地表达外源蛋白质的新载体，以及开发了一种在微生物表面上表达大量外源蛋白质的方法，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术旨在提供一种表面表达载体，该表面表达载体使用源自枯草芽孢杆菌变种Chungkookjang(Bacillussubtilisvar.Chungkookjang)菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶(poly-gamma-glutamatesynthetase)复合物基因作为能够在微生物表面上表达大量的两种外源蛋白质的表面锚定基序，并且使用源自干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的醛缩酶启动子和半乳糖变旋酶启动子，在微生物表面上共表达两种靶蛋白，并且提供一种在用所述表面表达载体转化获得的转化体的表面上高效表达两种不同的外源蛋白质的方法。本专利技术还旨在提供一种方法，包括：选择源自芽孢杆菌菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白质作为能够在微生物表面上表达大量外源蛋白质的表面锚定基序；利用所选择的外膜蛋白质构建能够在微生物表面上表达外源蛋白质或肽的表面表达载体；以及在用所述表面表达载体转化获得的转化体的表面上高效表达外源蛋白质。技术方案为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，该表面表达载体包括：第一启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因和编码靶蛋白的基因；以及第二启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因和编码靶蛋白的基因。在本专利技术中，第一启动子可以由SEQIDNO：1表示。在本专利技术中，第二启动子可以由SEQIDNO：2表示。在本专利技术中，编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因可以源自产生γ-谷氨酸合成酶复合物的芽孢杆菌菌株。在本专利技术中，可以在编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因的末端插入接头，并且编码靶蛋白的基因可以插入已插入的接头中。在本专利技术中，靶蛋白可以是其中该靶蛋白的一部分氨基酸序列已经被移除或者以定点方式突变以便有利于表面表达的一种蛋白质。在本专利技术中，第一启动子可以是源自乳酸菌的醛缩酶启动子(Pald)。在本专利技术中，第二启动子可以是源自乳酸菌的半乳糖变旋酶启动子(Pgm)。在本专利技术中，所述载体可以应用于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。本专利技术还提供一种用所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，该表面表达载体包括：第一启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因；以及第二启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181010 KR 10-2018-01205471.一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，该表面表达载体包括：第一启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因；以及第二启动子、编码用于表面锚定的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因、和编码靶蛋白的基因。


2.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述第一启动子由SEQIDNO：1表示。


3.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述第二启动子由SEQIDNO：2表示。


4.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因源自芽孢杆菌(Bacillussp.)菌株。


5.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，在所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因的末端插入接头，并且所述编码靶蛋白的基因插入已插入的接头中。


6.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述靶蛋白是其中该靶蛋白的一部分氨基酸序列已经被移除或者以定点方式突变以便有利于表面表达的一种蛋白质。


7.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述第一启动子是源自乳酸菌的醛缩酶启动子(Pald)。


8.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述第二启动子是源自乳酸菌的半乳糖变旋酶启动子(Pgm)。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的表面表达载体，其中，所述载体应用于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。


10.一种用权利要求1至8中任一项所述的表面表达载体转化的微生物。


11.根据权利要求10所述的微生物，其中，用于转化的微生物是经修饰使其不产生参与所表达的靶蛋白降解的胞内或胞外蛋白酶，以便有利于所述靶蛋白的细胞表面表达的微生物。


12.根据权利要求10所述的微生物，其中，该微生物是乳酸菌。


13.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因是pgsA并具有SEQIDNOs：21至24和32至34中的任意一种核苷酸序列。


14.根据权利要求13所述的表面表达载体，其中，所述基因pgsA源自产生聚-γ-谷氨酸的芽孢杆菌(Bacillussp.)菌株。


15.根据权利要求13所述的表面表达载体，其中，所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA具有SEQIDNO：25的核苷酸序列。


16.根据权利要求13所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴永铁，奇大殷，南坰骏，边世恩，文哈娜，姜显俊，咸京洙，
申请(专利权)人：生物领先公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR