利用源自芽孢杆菌菌株的聚γ-谷氨酸合成基因的表面表达载体以及使用该载体在微生物表面表达蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及具有用于编码聚γ

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用源自芽孢杆菌菌株的聚
γ-谷氨酸合成基因的表面表达载体以及使用该载体在微生物表面表达蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及利用外膜蛋白(pgsA)在微生物表面表达外源蛋白的新载体，所述外膜蛋白(pgsA)源自Bacillus sp.菌株并参与聚γ-谷氨酸的合成。此外，本专利技术涉及通过利用外膜蛋白在微生物表面上表达外源蛋白来生产蛋白的方法，所述外膜蛋白源自Bacillus sp.菌株并参与聚γ-谷氨酸的合成。

技术介绍

[0002]细胞表面展示是指将蛋白质或肽与适当的锚定基序(anchoring motif)融合并在革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌、真菌、酵母或动物细胞的表面上表达的技术(Lee S.Y.等，Trends Biotechnol.，21:4552，2003)。根据1980年代开发的第一种细胞表面展示技术，使用具有相对简单表面的噬菌体，将肽或小蛋白与丝状噬菌体的pIII融合，并在噬菌体表面上表达。因此，细胞表面展示技术被称为表面表达系统。将使用噬菌体的细胞表面展示用于抗体的抗体筛选或者表位、高亲和力配体等的筛选，但是局限在于可在噬菌体表面上表达的蛋白质的大小相对有限。因此，作为其替代，已经开发出使用细菌的细胞表面表达。这是利用微生物(例如细菌或真菌)的表面蛋白作为表面锚定基序在微生物表面稳定表达外源蛋白的领域。
[0003]为了利用特定有机体的外膜蛋白在细胞表面表达外源蛋白，应通过将合适的表面蛋白和外源蛋白在基因水平上彼此连接来生物合成融合蛋白，并且它们应稳定地穿过内膜，并应保持锚定在细胞表面上。为此，优选使用具有以下性质的蛋白质作为表面锚定基序：首先，该蛋白质应在其N端具有能够穿过内膜的分泌信号；第二，该蛋白质应具有可稳定地锚定至外膜表面的靶向信号；第三，该蛋白质应在不对细胞生长产生不利影响的范围内在细胞表面上大量表达，以便使该蛋白质能够表现出高活性；最后，该蛋白质无论其大小都应稳定表达，以便使其可用于各种反应(Georgiou等，TIBTECH，11:6，1993)。该表面锚定基序需要进行基因工程化，以将其插入宿主细胞表面上的外膜蛋白的N端或C端或者以将其插入该蛋白的中心(Lee等，TIBTECH，21:45，2003)。
[0004]为了使蛋白质在细菌表面上表达，能够使在细胞中生物合成的蛋白质穿过细胞膜的分泌信号应位于蛋白质的一级序列上。另外，在革兰氏阴性细菌的情况下，蛋白质应穿过内膜和周质空间，并应被插入和锚定至外膜，以便从膜上突出。
[0005]在细菌的情况下，具有这种分泌信号以及可稳定地锚定至细胞表面的靶向信号的蛋白质的实例包括表面蛋白、特殊的酶、毒素蛋白等。事实上，如果将这些蛋白质的分泌信号和靶向信号与适当的启动子一起使用，则可在细菌表面成功表达蛋白质。
[0006]用于外源蛋白的表面表达的细菌表面蛋白可大致分为四种类型：细胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白和细胞表面蛋白。至今，已尝试使用主要存在于革兰氏阴性细菌中的表面蛋白(例如LamB、PhoE、OmpA等)在细菌表面表达必需的外源蛋白。当使用这些蛋白质时，将外源蛋白插入到细胞表面上的突出环(protruding loop)中，因此从结构上来讲可插入的
蛋白质的大小受到限制。另外，由于待插入的外源蛋白的C端和N端应在空间上彼此靠近，因此存在当C端和N端之间的距离远时要通过接头肽使两个末端彼此靠近的问题。
[0007]事实上，当利用LamB或PhoE来插入由50个-60个以上氨基酸或更多个氨基酸组成的外源多肽时，由于结构限制导致未形成稳定的膜蛋白[Charbit等，J.Immunol.，139：1658-1664(1987)；Agterberg等，Vaccine，8：85-91(1990)]。尽管也存在利用OmpA将外源蛋白插入突出环中的情况，但是为了克服结构限制，仅使用含有能够锚定至外膜的最小靶向信号的OmpA片段。作为该方法，存在将β-内酰胺酶与OmpA靶向信号的C端连接并在细胞表面表达的情况。
[0008]另外，近年来，尝试了利用源自Pseudomonas sp.的冰核蛋白(ice-nucleation protein，INP)作为革兰氏阴性细菌的外膜蛋白进行表面表达[Jung等，Nat.Biotechnol，16：576-560(1998)；Jung等，Enzyme Microb.Technol，22(5)：348-354(1998)；Lee等，Nat.Biotechnol，18：645-648(2000)]。Jung等将果聚糖蔗糖酶(levansucrase)融合至由N端、中间重复区域和C端组成的冰核蛋白的C端，还将羧甲基纤维素酶融合至其中中间重复区域被删除进而由N端和C端组成的冰核蛋白的C端，使每种酶进行表面表达，并分析每种酶的活性。此外，Lee等将乙型肝炎病毒表面抗原和丙型肝炎病毒核心抗原融合到冰核蛋白(所述冰核蛋白由N端或者N端和C端构成)的各个末端，在伤寒沙门氏菌Ty21a菌株的表面表达这些抗原，然后证实这些抗原可用作复杂的活疫苗。
[0009]脂蛋白也是被用来表面表达的表面蛋白。特别地，大肠杆菌(E.coli)脂蛋白在N端具有分泌信号并且可穿过内膜，并且位于其末端的L-半胱氨酸直接共价连接至外膜脂质或内膜脂质。主要的脂蛋白Lpp在N端与外膜结合，并在C端与细胞膜(肽聚糖(PG))结合，因此当它与外膜蛋白OmpA片段连接时，外源蛋白可被分泌到外膜并在表面表达[Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，489：2713-2717(1992)]。利用脂蛋白的这种性质，将另一脂蛋白TraT用于对肽(例如脊髓灰质炎病毒的C3表位)进行表面表达[Felici等，J.Mol.Biol.，222：301-310(1991)]。另外，还将肽聚糖相关脂蛋白(peptidoglycan-associated lipoprotein，PAL，其确切功能尚不明确)用于重组抗体表面表达[Fuchs等，Bio/Technology，9:1369-1372(1991)]。在这种情况下，将PAL的C端连接至细胞壁，并将其N端连接至重组抗体，由此对融合蛋白进行表面表达。
[0010]也可将穿过外膜的分泌蛋白用作表面蛋白。然而，在革兰氏阴性细菌的情况下，分泌蛋白并不发达，并且只有在存在参与分泌蛋白的特殊分泌机制的蛋白的情况下才有一些分泌蛋白在其帮助下穿过外膜。例如，Klebsiella sp.普鲁兰酶是一种脂蛋白，其N端通过被脂质取代而锚定至外膜，然后被完全分泌到细胞培养介质中。Kornacker等使用普鲁兰酶的N端片段将β-内酰胺酶在细胞表面表达，但缺点是所表达的普鲁兰酶/β-内酰胺酶融合蛋白被临时锚定至细胞表面，然后被释放到细胞培养介质中。另外，当利用普鲁兰酶的N端片段表达周质空间碱性磷酸酶时，由于至少14种蛋白质参与了碱性磷酸酶的分泌，因此不能稳定地在表面表达该酶[Kornacker等，Mol.Microl.，4：1101-1109(1990)]。
[0011]源自具有独特分泌系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，所述表面表达载体包含：编码聚γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsA基因；以及编码所述靶蛋白的基因，其中，所述编码聚γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsA基因具有SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24-SEQ ID NO:26中任一项的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述pgsA基因源自产生聚γ-谷氨酸的Bacillus sp.菌株。3.如权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述编码聚γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsA基因具有SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24-SEQ ID NO:26中任一项的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述编码聚γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsA基因具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列。5.如权利要求1所述的表面表达载体，其中，在所述pgsA基因的末端插入接头，并且将编码所述靶蛋白的基因插入到所插入的接头中。6.如权利要求1所述的表面表达载体，其中，所述靶蛋白的氨基酸序列的一部分被移除或发生位点特异性突变，以有利于所述靶蛋白的表面表达。7.如权利要求1或4所述的表面表达载体，其中，所述核苷酸序列包含源自乳酸菌的醛缩酶启动子。8.一种转化有如权利要求1-7中任一项所述的表面表达载体的微生物。9.如权利要求8所述的微生物，其中，用于获得经转化的微生物的微生...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴永铁，全在原，朴洪圭，姜显俊，边世恩，朴光绪，奇大殷，
申请(专利权)人：生物领先公司，
类型：发明
国别省市：