Tob基因在哺乳动物中枢神经系统的功能及其应用技术方案

本发明专利技术涉及哺乳动物的Ｔｏｂ基因及其编码产物，及其在诊断和治疗记忆力下降、健忘症等方面用途。此外，本发明专利技术还涉及含Ｔｏｂ蛋白的药物组合物和保健品，以及Ｔｏｂ作为筛选提高记忆力、治疗健忘症或提高运动协调能力的相关药物方面的用途。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程和医学领域。更具体地，本专利技术涉及哺乳动物的Tob基因及其编码产物，及其在诊断和治疗记忆力下降、健忘症等方面用途。此外，本专利技术还涉及含Tob蛋白的药物组合物和保健品，以及Tob作为筛选提高记忆力、治疗健忘症或提高运动协调能力的相关药物方面的用途。已知ErbB-2基因编码了一个受体型酪氨酸蛋白激酶(receptor-type proteintyrosine kinase，RPTK)，在细胞生长分化方面发挥重要的作用。它的过量表达能导致肿瘤发生，但其中的机制还有待阐明。1996年，日本的研究人员发现了一个新的与ErbB-2基因产物p185erbB2相互作用的蛋白分子-Tob(Transducer of ErbB-2)，并克隆了人Tob基因的cDNA序列。Tob与已知的抗增殖因子BTG-1具有一定的同源性。研究显示，与BTG-1相似，Tob也表现出抑制细胞生长的作用，但其作用为p185erbB2所拮抗。随后在人和小鼠，Tob/BTG-1家族的其它成员相继被发现，不过其功能研究仅限于抑制细胞增殖方面。学习和记忆是脑的基本功能。在高等动物，海马是内侧颞叶的一个脑结构，将之损毁后，新的记忆无法形成。海马的突触具有很强的可塑性。海马突触可被诱导产生及维持长时程增强(long-term potentiation，LTP)，与LTP诱导或维持环节相关的任意一种蛋白质的编码基因被剔除(knockout)后，海马就不再有LTP现象，并且动物也就不能形成记忆。因此，海马作为学习和记忆的重要结构，LTP作为学习记忆的突触机制，已被广大神经科学家所接受。然而，迄今为止对于参与或影响记忆的各种蛋白质还知之甚少。因此，本领域迫切需要发现新的与记忆有关的蛋白质，以及开发改善记忆或治疗健忘症的药物。因此，本专利技术的目的就是提供一种与记忆有关的蛋白-Tob蛋白，及其在诊断、改善、或治疗记忆力下降和健忘症方面的用途。本专利技术的另一目的是提供含有Tob蛋白的药物组合物、保健品。在本专利技术的第一方面，提供了一种对个体的健忘症易感性进行诊断的方法，它包括步骤检测该个体的Tob基因、转录本和/或蛋白，并与正常的Tob基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患健忘症的可能性高于正常人群。较佳地，被检测的是人Tob的基因或转录本，并与正常人Tob核苷酸序列比较差异。在本专利技术的第二方面，提供了一种治疗健忘症的方法，包括步骤给需要所述治疗的病人施用安全有效量的正常Tob蛋白。在本专利技术的第三方面，提供了一种提高哺乳动物记忆力或运动协调能力的方法，包括步骤给需要的对象施用安全有效量的Tob蛋白。在本专利技术第四方面，提供了一种保健品，它含有哺乳动物的Tob蛋白或其活性片段。在本专利技术的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的哺乳动物的Tob蛋白以及药学上可接受的载体。较佳地，所述的Tob蛋白选自下组动物的Tob蛋白人、大鼠和小鼠。在本专利技术的第六方面，提供了一种检测健忘症易感性的试剂盒，它包括特异性扩增Tob基因或转录本的引物，或者与Tob蛋白特异性结合的抗体。在本专利技术的第七方面，提供了一种筛选治疗健忘症或提高运动协调能力的药物的方法，它包括步骤(1)将Tob基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备表达Tob蛋白的细胞株(2)向步骤(1)中的表达Tob蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测Tob蛋白表达量的变化；促进Tob蛋白表达量增加的化合物就是治疗健忘症或提高运动协调能力的候选药物。在本专利技术的第八方面，提供了一种分离的Tob蛋白，它包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。在附图中，附图说明图1是人、小鼠和大鼠Tob蛋白的保守区域的比较。图中，humantob为人Tob；mousetob为小鼠Tob；rattob为大鼠Tob。图2是大鼠Tob mRNA的表达谱。其中1-9各泳道分别是脑、海马、心脏、肠、肾、肝、肺、肌肉和脾脏。图3是大鼠Tob mRNA在海马中的分布图。Tob mRNA主要在海马DG、CA1和CA3区被检出。图4是小鼠Tob mRNA在脑内的分布图。Tob mRNA主要在海马及小脑皮层被检出。图5是水迷宫示意图，图中的“○”表示隐藏平台的所在位置。图6显示了Tob基因的反义序列核酸对大鼠Morris水迷宫学习和记忆保持的影响。图7显示了在对照组和反义核酸组大鼠海马CA1区记录到的LTP。图8显示了在九种不同品系小鼠中，Tob反义核酸序列均对记忆能力有负面影响。第1组为BALB/c小鼠+盐水；第2组为BALB/c小鼠+Tob随机序列；第3-9组为不同品系小鼠+Tob反义序列。如本文所用，术语“Tob蛋白”和“Tob多肽”可互换使用，指在哺乳动物的海马中特异性表达的、氨基酸序列与人、大鼠或小鼠的Tob氨基酸序列有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上同源性的多肽。此外，Tob的活性片段、保守性多肽、或活性衍生物可用于本专利技术。本专利技术人经过广泛而深入的研究，不仅克隆了大鼠的Tob cDNA序列，而且还利用不同的动物行为学模型，对Tob基因在学习和记忆过程中的功能进行了研究。意外地发现，Tob与记忆以及运动协调能力有关。以人和小鼠Tob1基因的cDNA保守区域为参照设计了一对引物，通过PCR，在8周大鼠脑cDNA文库中克隆了一段DNA序列。测序结果表明，该序列长度为604bp，与人和小鼠Tob1的cDNA相应区域分别具有91％和90％的同源性(图1)。以该段序列为探针，通过筛选成年大鼠脑cDNA文库，已克隆到大鼠Tob基因全长cDNA。Northern印迹杂交结果显示，大鼠Tob基因的表达模式与人和小鼠的比较相似(图2)。原位杂交结果表明，Tob基因在大鼠海马的神经元中有特异性表达(图3)。以大鼠为实验动物，通过水迷宫(Water Maze)和环境恐惧(Fear-conditioningto Context)等行为学实验模型对Tob基因进行了功能检测。向海马CA1区域定位注射Tob基因反义核酸，结果发现大鼠Tob基因的反义核酸可显著抑制大鼠的学习和记忆能力(图6)；抑制CA1区突触的长时程增强(LTP；图7)。以小鼠为实验动物，用Hamilton微量注射器定时定量将小鼠Tob基因的反义核酸注射到小鼠的侧脑室，并以注射生理盐水和随机序列核酸(Scramble)为对照组，而后考察实验组与对照组在步下法试验(Step-down Test)中的表现，并对所得数据进行统计分析。结果表明，实验组(注射Tob反义核酸组)的记忆能力与对照组相比有显著性减弱。为了进一步证实Tob基因与学习记忆的相关性，选用了9个不同品系的实验小鼠对之进行功能复筛。结果表明，Tob基因反义核酸在各品系中均能显著地抑制小鼠的学习记忆能力(图8)。此外，鉴于Tob mRNA在小脑皮层中的特异性表达，提示Tob蛋白与运动协调能力有关(图4)。根据蛋白质同源性比较，人类的Tob蛋白与小鼠和大鼠Tob蛋白高度同源(相同性在90％以上)。哺乳动物Tob蛋白的结构以及组织分布的特异性均提示，Tob蛋白在不同的哺乳动物中具有相同的功能，即可改善记忆力并且提高运动协调能力。因此人类的Tob蛋白同样与人的记忆力和运动协调能力有关，根据人T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对个体的健忘症易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤： 检测该个体的Ｔｏｂ基因、转录本和／或蛋白，并与正常的Ｔｏｂ基因、转录本和／或蛋白相比较， 存在差异就表明该个体患健忘症的可能性高于正常人群。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：景乃禾，李葆明，金玫蕾，高翔，王新明，郭宁，涂艳阳，张雪寒，
申请(专利权)人：中国科学院上海生物化学研究所，中国科学院上海生理研究所，中国科学院上海生物工程研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]