疫苗制造技术

本发明专利技术涉及用于检测含有一种Ⅲ型分泌系统的细菌致病菌株的一种基本方法。更具体地说，本发明专利技术涉及适用于病原体百日咳博德特氏菌的方法。此外，本发明专利技术涉及在这些区内新鉴定的多核苷酸、由它们编码的毒力多肽，并涉及这类多核苷酸和多肽的应用，还涉及它们的产生。更具体地说，本发明专利技术的多核苷酸和多肽涉及与百日咳博德特氏菌的Ⅲ型分泌系统相关的毒力效应蛋白，所述多核苷酸和多肽特别适用于疫苗目的。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于检测含有一种III型分泌系统的细菌致病菌株并鉴定所述菌株染色体中毒力基因所在区的一种基本方法。更具体地说，本专利技术涉及适用于病原体百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的方法。此外，本专利技术涉及这些区内新鉴定的多核苷酸、由它们编码的毒力多肽，并涉及这类多核苷酸和多肽的应用，还涉及它们的产生。
技术介绍
III型分泌系统病原菌侵入广泛宿主范围中的许多不同的生态位，并引起各种各样的综合征。这是由于先前认为每种疾病是由独特的分子机制诱发的。然而，这类机制的范围没有像最初想象地那样广；而是，细菌利用许多共同分子工具达到各种各样目的。在这些工具中有III型分泌系统，所述系统给细菌提供将毒力因子直接靶向宿主细胞的工具。然后这些因子干预宿主细胞的功能以对病原体有益。III型输出系统负责分泌沙门氏菌属(Salmonella)和志贺氏菌属(Shigella)侵入和毒力因子、致肠病大肠杆菌(EPEC)信号转导分子、数种植物病原体(例如野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria))中的毒力因子以及耶尔森氏菌属(Yersinia)中的Yop蛋白。Yop输出机制已经是研究最透彻的III型分泌器(参见例如Allaoui等，1994；Bergman等，1994)。在该系统中，推测超过20种不同的Ysc/Lcr蛋白(所有均由毒力质粒pYV编码)组成一种跨越耶尔森氏菌属胞外被膜的分泌通道。除包括在所述分泌器中的这些元件外，pYV质粒还编码Yop蛋白，所述Yop蛋白是所分泌的底物并且看来是毒力的实际效应物。源自不同物种的III型分泌系统的比较研究表明，分泌器的组分是保守的(Gygi等，1995；Bogdanove等，1996)。另外，已经在参与鞭毛装配的决定子中发现了同系物，表明该分泌途径可能涉及表面细胞器的生物合成(Ramakrishnan等，1991)。然而，相比之下，所分泌的底物没有共享相似性，只是在少数情况下例外。因此，被放弃的对应于每种疾病的独特分子机制的概念可能在效应蛋白水平上再现。致病性岛(pathogenicity island)致病性岛已经成为细菌毒力领域中的一个新课题。虽然它们可以包含III型分泌系统，但是它们不仅仅如此。毒力基因研究的早期，观察到这些基因中的许多在质粒上存在。然而，在染色体上也发现了大量的毒力基因。意想不的是，染色体毒力基因在功能相关组群中还常常聚集成簇。这样的毒力基因群产生致病性岛(Pai)的概念，所述致病性岛可以被定义为携带毒力基因的密集的、独特的遗传单位。通常侧翼为同向重复序列的这些单位占据大的染色体区(通常＞30kb)并存在于致病菌株中，而不存在或偶尔分布于细菌菌种的较低致病性(或无致病性)的菌株中。这些DNA区段时常与位于其边界的tRNA基因和/或插入序列(IS)元件相关。另外，它们的G+C含量通常与宿主细菌DNA的G+C含量不同，说明一种异种起源。已经在越来越多的细菌病原体中发现了致病性岛，所述病原体包括不同类别的大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、耶尔森氏菌(Yersinia spp)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)等。最初深入细致研究的致病性岛是Pai I和Pai II，其编码致尿路病大肠杆菌的溶血素决定子。这两种Pai邻接同向重复序列，并可以以频率10-4从染色体中缺失，产生无毒性的突变菌株。另一35kb致病性岛最近已经在致肠病大肠杆菌(EPEC)的染色体上鉴定出，并发现其编码所有已知涉及所谓“粘附与消除(attaching and effacing)”(AE)损害形成的决定子。因此，将该区称为“肠细胞消除基因座”(LEE)。尽管事实上致尿路病大肠杆菌和致肠病大肠杆菌引起完全不同的传染病，但是致尿路病菌株的Pai I和EPEC的LEE基因座在完全相同的位置插入至大肠杆菌染色体中。当某些研究者支持必需包括其染色体位置的致病性岛定义时，其它研究者已经将所述概念延伸至多区组(block)毒力基因，而与其在染色体、质粒或噬菌体中的位置无关。一方面，噬菌体和质粒可以容易地插入染色体中和从染色体中切除，并且另一方面，隐蔽性质粒复制起点或噬菌体相关序列在Pai中被检测到，这一事实支持后一较少限制的定义。编码III型分泌系统的致病性岛(PAI)包括的基因分为两类I类和II类。I类包括编码分泌器组分及其表达的调节物的基因，II类包括编码分泌的效应蛋白的基因。耶尔森氏菌属的lcrD和yscU均属于I类。I类决定子的精确功能还不大了解。虽然有时不能明确地清楚区分I类组分和II类组分，但是I类基因可以鉴定为存在于许多不同种中，并且它们相应的基因序列的比较表明，等效基因共享显著水平(yscI、yscO)或甚至高水平(lcrD、yscU、yscN)的序列相似性(Hueck，1998)。第二类基因(II类)编码构成由易位子分泌的底物的蛋白。看来这些蛋白为真正的毒力效应物并被称为靶蛋白、毒力效应蛋白或简称为效应物。与I类基因产物中普遍的情况相反，所述效应物在种之间没有共享相似性或共享的相似性非常低地。效应蛋白是呈现最大生物、疫苗和诊断潜能的那些蛋白。本专利技术人已经发现，单个致病性岛内的I类和II类基因的聚簇，通过靶向可以采用其大量的直向同源基因其中一种的已知序列鉴定的I类基因，提供方便地发现和鉴定未知II类基因的机会百日咳博德特氏菌百日咳是一种由百日咳博德特氏菌感染引起的疾病，并且是一种严重衰弱的人类疾病，尤其是在婴幼儿中。虽然可获得有效抵抗该疾病的全细胞和无细胞疫苗，但是仍需要鉴定进一步高度纯化的、可被用于更有效的百日咳疫苗中的百日咳蛋白。虽然知道许多百日咳毒力相关因子，例如百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、pertactin，它们已经包括在多种无细胞疫苗中，但是没有方便的应用百日咳基因组鉴定其它毒力因子的基因方法(除了麻烦地对完整基因组测序之外)。虽然最近已经显示I类III型分泌系统毒力基因存在于支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)和百日咳博德特氏菌(Yuk等，1998)，但是没有全面地分析博德特氏菌属中的致病性岛，直到本专利技术才了解效应物基因在这种致病性岛中的身份和表征。专利技术概述一方面，本专利技术涉及鉴定含有III型分泌系统的细菌菌株中的新毒力基因的方法。具体来讲，本专利技术允许鉴定与含有III型分泌系统基因的致病性岛相关的效应物毒力基因。本专利技术的另一方面是含有III型分泌系统的致病细菌菌株的鉴定方法。本专利技术的另一方面涉及百日咳博德特氏菌BopN、Orf1、Orf2、Orf3、Orf4、Orf5、Orf6、Orf7、Orf8、Orf9、Orf10、Orf11、Orf12、Orf13、Orf14、Orf15效应蛋白以及编码它们的相应的多核苷酸序列。虽然已经报道了III型分泌系统和致病性岛的基本概念，但是迄今为止仍没有解决如何简便而可靠地鉴定是否任何特定的生物都具有这种细胞机器的问题。这种方法极其有用，可用于确定特定菌株是否在致病性岛内具有III型分泌系统，表征致病性岛内的未知毒力基因，以及用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，它包含与选自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０和７２的氨基酸序列具有至少７５％同一性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：A波伦，A福康尼尔，E格德弗罗伊德，
申请(专利权)人：布鲁塞尔大学，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]