高度增殖的重组细胞制造技术

本发明专利技术涉及增加细胞生长的方法，其特征在于tldD和/或tldE基因中的缺失或一个或多个突变，与dam中的一个或多个突变，或者dam基因中的部分缺失或缺失相结合，本发明专利技术还涉及获得的细胞并涉及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及高度增殖(重组)的细胞，它的制备方法以及它的用途，尤其是生产感兴趣的分子。
技术介绍
重组微生物被这些使用(以肥料、益生菌、疫苗等形式)或者用于以廉价和灵活的方式来生产多种分子,如DNA构建体、多肽等。然而，更高的产量需要高密度培养微生物，尤其是细菌细胞，而这仍然是困难的。此外，发酵是在肉汤(发酵液)中进行微生物培养的结果，并且导致乙酸盐/酯的大量生产(尤其是当糖酵解超过Krebs循环时)，进而抑制它们的生长。 已经实现了数种可能性，如透析、过滤以及添加纯氧。通过透析或过滤从微生物中分离乙酸盐/酯允许所述微生物进一步生长，具有以下限制，例如价格以及得到的产物在培养基中可能的稀释度。添加氧气有利于氧化代谢，而不利于糖酵解，以及乙酸盐/酯的消耗。然而，这种方法需要将更复杂的设备添加至到生物反应器中。欧洲专利申请EP0316229描述了提供降低的乙酸盐/酯产量以及增加的细胞密度和随后产量的突变的大肠杆菌菌株。然而，在这个专利申请中未公开得到的一个或多个突变，以及受影响的一个或多个途径。经鉴别TldD和tldE基因对于小菌素B17的加工和成熟是必要的(Allali, N. , Afif, H. , Couturier, M. and Van Melderen, L. (2002))。大肠杆菌的高度保守的TldD和tldE蛋白涉及小菌素B17的加工以及CcdA降解(J. Bacteriol，184，3224-3231)。由于在许多真细菌和古细菌中TldD和tldE蛋白是高度保守的，这说明它们具有其他重要作用。由dam基因编码的甲基化酶(Dam甲基化酶)将甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸转移到序列GATC中腺嘌呤残基的N6位置上。Dam涉及对于特定内切核酸酶的耐受性，涉及DNA的修复机制以及涉及基因表达的控制。
技术实现思路
本专利技术提供了不存在现有技术缺点的新型重组细胞以及它们的制备方法。优选地，本专利技术提供了具有改进特性(像降低的乙酸盐/酯产量以及对于乙酸盐/酯降低的敏感度)的这类细胞，与野生型菌株相比较具有延长的对数生长期以及产生更高数量的活细胞的细胞，用于改善(增加)有价值的生物或化学下游产物的产量，所述有价值的生物或化学下游产物是指从这些细胞中获得的内源性以及外源性分子，像核酸构建体、多肽、糖类、脂质、维生素等。此外，本专利技术提供了具有增加的质粒数量的细胞。本专利技术的第一方面涉及用于改善(增加)(原核生物)细胞生长的方法，其中(天然地)包括(野生型和/或功能性)tldD和/或tlaE、以及dam核苷酸序列的这种细胞(野生型细胞)经受所述tldD和/或tlaE、以及dam核苷酸序列的部分或全部缺失，或者经受使TldD和/或TlaE、以及Dam蛋白(的功能)失活的一个或多个突变。该一个或多个突变包括在这些tldD和/或tlaE、以及dam核苷酸序列中的一个或多个突变，优选地引起核苷酸的插入或缺失，和/或引入终止密码子和/或产生具有用一个氨基酸取代另一个氨基酸的翻译的肽链，并且还(有可能地)包括在这些tldD和/或tlaE、以及dam序列的下游和/或上游起作用并且产生相同表型的一个或多个核苷酸序列的一个或多个突变。优选地，使Dam蛋白失活的突变将其活性部分地失活。 部分失活优选地是指截短该蛋白保留野生型蛋白的N-端部分，并且有可能产生比野生型活性更低活性的蛋白。根据本专利技术，使Dam蛋白失活的一个突变(优选地)是dam : :kan突变。有利地，dam序列的3’区域的缺失产生由dam天然序列的5’区域组成的序列，更优选地，从核苷酸I开始直至核苷酸178，并且对由天然Dam蛋白的59个氨基端氨基酸(大肠杆菌；SEQ. ID. NO. 8)组成的称为Daml-59多肽的进行编码的序列。这个核苷酸序列称为短dam序列。短dam序列(大肠杆菌；SEQ. ID. NO. 7)缺少从核苷酸179至核苷酸837的dam天然序列的3’末端。在dam kan突变体中获得同样的突变。 可替代地，在dam序列中的一个或多个突变可以是完全缺失或者使其活性完全失活的一个或多个突变。有利地，用于改善(增加)(原核生物)细胞生长的本方法还包括使(原核生物)细胞经受csrA核苷酸序列的3’部分的缺失或者经受使这种CsrA蛋白的活性降低(部分失活)的一个或多个突变的步骤。优选地，csrA序列3’区域的缺失产生了由csrA天然序列的5’区域组成的序列，更优选地，从核苷酸I开始直至核苷酸150，并且对由天然CsrA蛋白的50个氨基端氨基酸组成的称为CsrAl-50的多肽进行编码的序列。这种核苷酸序列称为短csrA序列。该短csrA序列缺少从核苷酸151至核苷酸186的csrA天然序列的3’末端。优选地，在用于改善(增加)(原核生物)细胞生长的这种方法中，使这种(原核生物)细胞生长在补充有碳源的培养基中，所述碳源优选地是糖分解碳源和/或选自由甘油、丙酮酸盐和/或糖分解糖类组成的组中，更优选葡萄糖。本专利技术的一个相关方面涉及用于在(原核生物)细胞中增加质粒数量(相对丰度；μ g质粒DNA : μ g染色体DNA)的方法，包括使(这种(原核生物)细胞的)tldD和/或tldE基因经受使TldD和/或TldE蛋白失活的一个或多个突变的步骤。优选地，在用于增加质粒数量的这种方法中，与对照细胞(参照或野生型细胞)相比较，经受使TldD和/或TldE蛋白失活的一个或多个突变的(重组)细胞的质粒数量增加了至少3倍，优选至少10倍。该一个或多个突变包括在tldD和/或tldE核苷酸序列中的一个或多个突变，优选地引起核苷酸的插入或缺失，和/或引入终止密码子和/或产生具有用一个氨基酸取代另一个氨基酸的翻译的肽，而且还包括在这些tldD和/或tldE序列的下游和/或上游起作用并且产生相同表型的一个或多个核苷酸序列的一个或多个突变。使TldD和/或TldE蛋白失活的优选的突变是这些tldD和/或tldE基因的完全缺失。优选地，在用于增加质粒数量的这种方法中，质粒数量增加至少3倍。有利地，在用于增加质粒数量的这种方法中，质粒是低拷贝数量的质粒(即在正常条件下具有少于50个拷贝/细胞，优选地少于20个拷贝/细胞，更优选地少于15、10、9、8、7、6、或者甚至少于5个拷贝/细胞的质粒)。 优选地，用于增加质粒数量的这种方法进一步包括使(原核生物)细胞经受dam和/或csrA核苷酸序列的部分或全部缺失或者经受使产生的Dam和/或CsrA蛋白的活性失活的一个或多个突变的步骤。优选地,使Dan和/或CsrA蛋白失活的这些突变是dam核苷酸序列3’部分的缺失和/或csrA核苷酸序列3’部分的缺失，这导致产生截短的(短)Dam和/或截短的(短)CsrA蛋白。优选地，在用于增加质粒数量的这种方法中，使(原核生物)细胞生长在补充有碳源的培养基中，所述碳源优先选自由糖分解碳源组成的组中和/或选自由甘油、丙酮酸盐和/或糖分解糖类组成的组中，更优选葡萄糖。本专利技术的另一个方面涉及分离的(纯化的)高度增殖(重组)的(原核生物)细胞，其中tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列被部分地或全部地缺失或者包括使该tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列失活的一个或多个突变(优选地，其中使Da本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳伦斯·范梅尔德恩，约翰·蒂默曼斯，
申请(专利权)人：布鲁塞尔大学，
类型：
国别省市：