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一种调控Hh信号通路抑制HL‑60细胞的检测方法技术

技术编号:15744734 阅读:192 留言:0更新日期:2017-07-02 20:22
本发明专利技术公开了一种调控Hh信号通路抑制HL‑60细胞的检测方法,所述检测方法包括:采用试剂盒检测不同实验组间HL‑60细胞的增殖,采用双染检测各组HL‑60细胞凋亡率,采用半定量RT‑PCR方法检测各实验组Hedgehog信号通路组成成分GLI 1基因及凋亡基因BCL‑2、BCL‑XL的表达,采用免疫荧光法检测GLI 1蛋白的表达。本发明专利技术采用人急性髓系白血病细胞株HL‑60与HS‑5细胞体外建立共培养模式,模拟体内白血病细胞与其周围的造血微环境的相互作用,研究造血微环境对白血病细胞凋亡的影响及作用的可能机制,为探索以阻断二者相互作用为靶标的白血病治疗药物的研制奠定理论基础。

A Hh signaling pathway to inhibit HL 60 cell detection method

The invention discloses a Hh signaling pathway to inhibit HL cell 60 detection methods, the detection method comprises the proliferation detection kit in different experimental groups HL 60 cells, using double staining to detect apoptosis of HL 60 cells rate, using semi quantitative RT method for detection of PCR in each experimental group Hedgehog signaling pathway components GLI 1 gene and apoptosis gene expression of BCL 2, BCL XL, expression by immunofluorescence detection of GLI protein 1. The invention adopts the HL human acute myeloid leukemia cell lines 60 and HS establish a co culture model of 5 cell in vitro, to simulate the interaction between leukemic cells and its surrounding hematopoietic microenvironment, the possible mechanism of hematopoietic microenvironment on apoptosis of leukemia cells and to explore the role, to block the interaction between the two theoretical the foundation for the development of drugs that target the treatment of leukemia.

【技术实现步骤摘要】
一种调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法
本专利技术属于医学
,尤其涉及一种调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法。
技术介绍
骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSC).是造血微环境(hematopoieticmicroenvironment,HM)的核心组成成分。骨髓造血微环境中的骨髓基质细胞能调节急性髓系白血病(acutemyelogenousleukemia,AML)的增殖、存活、耐药。因此,除了直接针对急性髓系白血病的治疗外,阻断白血病与骨髓基质细胞的相互作用将为白血病的治疗提供新的策略。Hedgehog(HH)蛋白属于分泌蛋白家族,广泛表达于哺乳动物,非哺乳动物等多个物种,参与调控多种肿瘤形成,器官成熟、血管生成,干细胞分化,免疫细胞以及胚胎发育。Hh信号可以通过调节肿瘤细胞增殖、分化、免疫调节来创造适合肿瘤生存的微环境,进而为肿瘤发展和转移创造环境。然而,骨髓造血微环境能否通过Hh信号影响HL-60细胞的存活仍然不清楚。现有技术不清楚HH信号通路在骨髓基质细胞对白血病细胞生长中是否有作用,所以,本专利技术探究骨髓基质细胞诱导的HH信号对HL-60细胞的存活的影响。HM是由基质细胞(即成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞,周围的网状细胞,间充质干细胞)和造血细胞、细胞外基质、可溶性因子、膜结合因子构成的复杂结构,它们协同支持正常造血。BMSC是骨髓造血微环境重要组成成分,骨髓造血微环境中的BMSC调节白血病细胞的增殖、分化、凋亡,此外BMSC作为白血病细胞的“避难所”有助于白血病细胞耐药和体内微小残留病灶形成。因此,除了针对白血病细胞的治疗,阐明白血病细胞和BMSC相互作用的机制,将为白血病治疗提供新的治疗策略。Hh信号通路参与调控器官成熟、血管生成、干细胞分化、免疫细胞以及胚胎发育,Hh信号通路的异常激活参与多种肿瘤发生,包括基底细胞癌,肺癌,乳腺癌,胃癌,肝癌,胰腺癌,前列腺癌,近年研究发现Hh信号通路在BMSC对慢性淋巴细胞性白血病,多发性骨髓瘤的保护中起重要作用。那么在BMSC对AML的保护作用中,该信号通路是否发挥作用呢?骨髓基质细胞HS-5可产生多种细胞因子(如GM-CSF、M-CSF、LIF等)促进骨髓前体细胞的增殖,支持长期造血,因此HS-5细胞能很好地体外模拟骨髓造血微环境。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法,旨在解决现有技术不清楚HH信号通路在骨髓基质细胞对白血病细胞生长中是否有作用,骨髓基质细胞诱导的HH信号对HL-60细胞的存活的影响的问题。本专利技术是这样实现的,一种调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法,所述调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法包括:采用试剂盒检测不同实验组间HL-60细胞的增殖;将HL-60细胞接种于有或无骨髓基质细胞HS-5的96孔板内,用酶标仪测各孔的吸光度OD值,绘制HL-60细胞的增殖曲线;采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测各组HL-60细胞凋亡率;将HL-60细胞接种于有或无HS-5细胞的24孔板内,每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞,上流式细胞仪检测;采用半定量RT-PCR方法检测各实验组Hedgehog信号通路组成成分GLI1基因及凋亡基因BCL-2、BCL-XL的表达;提取总HL-60细胞RNA,将mRNA逆转录为cDNA,逆转录产物进行GLI1,BCL-2、BCL-XL和GAPDH基因扩增;采用免疫荧光法检测GLI1蛋白的表达,收集HL-60细胞单独培养组;HL-60+GANT6110μmol/L培养组;HL-60+HS-5细胞培养组;HL-60+HS-5+GANT6110μmol/L培养组各组48h时HL-60细胞,PBS液洗,风干,兔抗人GLI1抗体孵育;FITC荧光标记山羊抗兔二抗,孵育,PBS液洗,封固,共聚焦显微镜下分析。进一步,所述实验组为:HL-60细胞单独培养组;HL-60+GANT6110μmol/L培养组;HL-60+HS-5细胞培养组;HL-60+HS-5+GANT6110μmol/L培养组。进一步,采用试剂盒检测不同实验组间HL-60细胞的增殖方法具体包括:将HL-60细胞按4×104ml-1接种于有或无骨髓基质细胞HS-5的96孔板内,100μl/孔,设定3个复孔;对照组仅接种骨髓基质细胞HS-5;每日固定时相点取1个96孔板,每孔加入10μlCCK8溶液作用2h,用酶标仪测450nm处各孔的吸光度OD值,绘制HL-60细胞的增殖曲线。进一步,采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率方法包括:将HL-60细胞按5×105ml-1接种于有或无HS-5细胞的24孔板内,每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞,用冷PBS洗涤2次,离心去上清液;用Annexin结合液重悬细胞,调整细胞浓度为1×106/mL,向细胞悬液加5μlAnnexinⅤ-FITC混匀,4℃避光孵育15min,加入10μlPI,4℃避光孵育5min,上流式细胞仪检测。进一步,RT-PCR检测HL-60细胞中Hedgehog信号通路成分和抑凋亡基因表达方法包括:RT-PCR法检测48h的HL-60细胞GLI1,BCL-2、BCL-XL和GAPDH的表达;提取总RNA,将mRNA逆转录为cDNA,逆转录产物进行GLI1,BCL-2、BCL-XL和GAPDH基因扩增,扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统拍照,照片用ImageJ进行mRNA表达分析和灰度扫描。进一步,免疫荧光法检测GLI1表达方法包括:收集HL-60细胞单独培养组;HL-60+GANT6110μmol/L培养组;HL-60+HS-5细胞培养组;HL-60+HS-5+GANT6110μmol/L培养组各组48h时HL-60细胞,冷PBS洗2次,100μL细胞混悬液均匀滴加至多聚赖氨酸包被的载玻片上风干,4%多聚甲醛固定30分钟,PBS液洗3次,5分钟/次,0.5%TritonX-100透膜处理10分钟,PBS液洗3次,5分钟/次,10%山羊血清37℃封闭1h,1∶100的兔抗人GLI1抗体4℃孵育过夜,PBS液洗3次,5分钟/次,FITC荧光标记1:150的山羊抗兔二抗室温避光孵育1h,PBS液洗3次,5分钟/次,终浓度为0.1mg/LPI室温避光孵育1分钟,PBS液洗3次,5分钟/次,封固,共聚焦显微镜下分析。进一步,调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法还包括:采用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料以表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比较符合正态分布采用LSD-t检验;以P<0.05为差异有统计学意义。进一步,骨髓基质细胞HS-5为:3×104ml-1,培养24h。进一步,HS-5细胞为:1×105ml-1,培养48h。进一步,GLI1,BCL-2、BCL-XL和GAPDH的RNA分别为:F5’-TCCTACCAGAGTCCCAAGTTTC-3’、F5’-GAGGAGCTCTTCAGGGACGG-3’、F5’-ATGGCAGCAGTAAAGCAAGCG-3’、F5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3本文档来自技高网
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一种<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/52/201710108524.html" title="一种调控Hh信号通路抑制HL‑60细胞的检测方法原文来自X技术">调控Hh信号通路抑制HL‑60细胞的检测方法</a>

【技术保护点】
一种调控Hh信号通路抑制HL‑60细胞的检测方法,其特征在于,所述调控Hh信号通路抑制HL‑60细胞的检测方法包括:采用试剂盒检测不同实验组间HL‑60细胞的增殖;将HL‑60细胞接种于有或无骨髓基质细胞HS‑5的96孔板内,用酶标仪测各孔的吸光度OD值,绘制HL‑60细胞的增殖曲线;采用AnnexinⅤ‑FITC/PI双染检测各组HL‑60细胞凋亡率;将HL‑60细胞接种于有或无HS‑5细胞的24孔板内,每日固定时相收集对数生长期HL‑60细胞,上流式细胞仪检测;采用半定量RT‑PCR方法检测各实验组Hedgehog信号通路组成成分GLI 1基因及凋亡基因BCL‑2、BCL‑XL的表达;提取总HL‑60细胞RNA,将mRNA逆转录为cDNA,逆转录产物进行GLI1,BCL‑2、BCL‑XL和GAPDH基因扩增;采用免疫荧光法检测GLI 1蛋白的表达,收集HL‑60细胞单独培养组;HL‑60+GANT61 10μmol/L培养组;HL‑60+HS‑5细胞培养组;HL‑60+HS‑5+GANT6110μmol/L培养组各组48h时HL‑60细胞,PBS液洗,风干,兔抗人GLI1抗体孵育;FITC荧光标记山羊抗兔二抗,孵育,PBS液洗,封固,共聚焦显微镜下分析。...

【技术特征摘要】
1.一种调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法,其特征在于,所述调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法包括:采用试剂盒检测不同实验组间HL-60细胞的增殖;将HL-60细胞接种于有或无骨髓基质细胞HS-5的96孔板内,用酶标仪测各孔的吸光度OD值,绘制HL-60细胞的增殖曲线;采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测各组HL-60细胞凋亡率;将HL-60细胞接种于有或无HS-5细胞的24孔板内,每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞,上流式细胞仪检测;采用半定量RT-PCR方法检测各实验组Hedgehog信号通路组成成分GLI1基因及凋亡基因BCL-2、BCL-XL的表达;提取总HL-60细胞RNA,将mRNA逆转录为cDNA,逆转录产物进行GLI1,BCL-2、BCL-XL和GAPDH基因扩增;采用免疫荧光法检测GLI1蛋白的表达,收集HL-60细胞单独培养组;HL-60+GANT6110μmol/L培养组;HL-60+HS-5细胞培养组;HL-60+HS-5+GANT6110μmol/L培养组各组48h时HL-60细胞,PBS液洗,风干,兔抗人GLI1抗体孵育;FITC荧光标记山羊抗兔二抗,孵育,PBS液洗,封固,共聚焦显微镜下分析。2.如权利要求1所述的调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法,其特征在于,所述实验组为:HL-60细胞单独培养组;HL-60+GANT6110μmol/L培养组;HL-60+HS-5细胞培养组;HL-60+HS-5+GANT6110μmol/L培养组。3.如权利要求1所述的调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法,其特征在于,采用试剂盒检测不同实验组间HL-60细胞的增殖方法具体包括:将HL-60细胞按4×104ml-1接种于有或无骨髓基质细胞HS-5的96孔板内,100μl/孔,设定3个复孔;对照组仅接种骨髓基质细胞HS-5;每日固定时相点取1个96孔板,每孔加入10μlCCK8溶液作用2h,用酶标仪测450nm处各孔的吸光度OD值,绘制HL-60细胞的增殖曲线。4.如权利要求1所述的调控Hh信号通路抑制HL-60细胞的检测方法,其特征在于,采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率方法包括:将HL-60细胞按5×105ml-1接种于有或无HS-5细胞的24孔板内,每日固定时相收集对数生长期HL-60细胞,用冷PBS洗涤2次,离心去...

【专利技术属性】
技术研发人员:魏虹邓磊
申请(专利权)人:石河子大学
类型:发明
国别省市:新疆,65

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