MACC1基因的多肽抑制剂及应用制造技术

本发明专利技术公开了MACC1基因的多肽抑制剂及应用，该多肽包含如下氨基酸序列：ETLGQPDAK(Xa)PCFQEDPMA(Xb)GTDELGCMIWN；其中，Xa和Xb选自M,Y,L,V,W或E。本发明专利技术提供的多肽抑制剂可以从转录和翻译水平抑制MACC1基因在HepG2细胞中的表达，为MACC1基因的有效抑制剂；同时，该MACC1基因的有效抑制剂可以显著抑制HepG2细胞的增殖和侵袭，该MACC1基因的有效抑制剂可以用于制备成抗肝细胞癌侵袭的药物。

【技术实现步骤摘要】
MACC1基因的多肽抑制剂及应用
本专利技术属于基因领域，具体涉及MACC1基因的多肽抑制剂及应用。
技术介绍
原发性肝癌是一种原发灶发生于肝细胞和肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其中肝细胞性肝癌(即肝细胞癌，HCC)是最主要的病理类型，占原发性肝癌90％以上。MACC1基因是2009年由STEIN等发现并命名的一个新基因。STEIN等研究发现，MACC1作为肝细胞生长因子(HGF)/C-met信号通路的一个关键调节因子，在结肠癌的侵袭和转移中发挥着重要作用，此外，刘清泉等发现MACC1基因可能在肝细胞癌的侵袭转移中发挥着重要作用，有可能成为肝癌治疗的新靶点之一(刘清泉等，MACC1基因在肝细胞癌中的表达及临床意义，华中科技大学学报，2010，39：22-24)。目前，尚未见MACC1基因多肽类抑制剂的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供MACC1基因的多肽抑制剂及应用。实现本专利技术上述目的技术方案如下：一种MACC1基因的抑制剂，该抑制剂为一种多肽，该多肽包含式(Ⅱ)氨基酸序列：ETLGQPDAK(Xa)PCFQEDPMA(Xb)GTDELGCMIWN；(Ⅱ)其中，Xa和Xb选自M,Y,L,V,W或E。优选地，Xa和Xb选自M或W。优选地，该抑制剂为下述多肽之一：ETLGQPDAKMPCFQEDPMAMGTDELGCMIWN；ETLGQPDAKWPCFQEDPMAWGTDELGCMIWN；ETLGQPDAKMPCFQEDPMAWGTDELGCMIWN；ETLGQPDAKWPCFQEDPMAMGTDELGCMIWN。优选地，多肽N和/或C末端被化学修饰。优选地，所述多肽的N末端被乙酰化修饰，C末端被酰胺化修饰。优选地，所述多肽形式如下：Ac-ETLGQPDAKMPCFQEDPMAMGTDELGCMIWN-NH2；Ac-ETLGQPDAKWPCFQEDPMAWGTDELGCMIWN-NH2；Ac-ETLGQPDAKMPCFQEDPMAWGTDELGCMIWN-NH2；Ac-ETLGQPDAKWPCFQEDPMAMGTDELGCMIWN-NH2。优选地，所述多肽为游离形式或药学上可以接受的成盐形式，包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐。上述抑制剂在制备抗肝细胞癌增殖和侵袭的药物中的应用。一种药物组合物，含有上述多肽抑制剂和药学上可以接受的辅料。上述组合物在制备抗肝细胞癌增殖和侵袭的药物中的应用。本专利技术的突出优点：本专利技术提供的多肽抑制剂可以有效抑制肝细胞癌中MACC1基因的表达，进而有效抑制肝细胞癌的侵袭转移，可以用于制备成抗肝细胞癌侵袭的药物。附图说明图1为多肽抑制剂对MACC1mRNA表达的影响；图2为多肽抑制剂对MACC1蛋白表达的影响。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本专利技术的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验材料本专利技术涉及的多肽通过本领域公知的标准多肽固相合成技术合成，采用芴甲氧羰基(Fmoc)N端保护策略。按照树脂固相合成的方法依次连接相应氨基酸，期间依次脱去Fmoc-保护基团，然后切肽，获得粗品，粗品经C18柱分离纯化，即可制得式(Ⅱ)所示的多肽。HPLC和MS检测确证了本专利技术多肽的结构，且纯度均≥98％。多肽Ⅱ-1至多肽Ⅱ-4的氨基酸序列如下，N末端和C末端未经化学修饰：ETLGQPDAKMPCFQEDPMAMGTDELGCMIWN(多肽Ⅱ-1)；ETLGQPDAKWPCFQEDPMAWGTDELGCMIWN(多肽Ⅱ-2)；ETLGQPDAKMPCFQEDPMAWGTDELGCMIWN(多肽Ⅱ-3)；ETLGQPDAKWPCFQEDPMAMGTDELGCMIWN(多肽Ⅱ-4)。人肝细胞癌细胞株HepG2由本公司分子药理实验室保存。胎牛血清购自杭州四季青公司。四甲基偶氮唑盐和二甲基亚砜均购自美国Sigma公司。兔抗人MACC1抗体购自SantaCruz公司，HRP标记山羊抗兔IgG二抗购自北京中衫金桥公司。Transwell小室均购自Millipore公司。PCR引物合成于广州锐博，RT-PCR试剂盒购自Takara公司。二、实验方法1、人肝细胞癌细胞株HepG2培养人原发性肝癌细胞株于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃、5％CO2培养，2-3d用0.25％胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行试验。2、MTT法检测多肽对HepG2增殖能力的影响取对数生长期的HepG2细胞，制成细胞悬液，以每孔5×104个细胞接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液。分为对照组、多肽Ⅱ-1组、多肽Ⅱ-2组、多肽Ⅱ-3组、多肽Ⅱ-4组。多肽组分别加入4、8、16、32、64μM的多肽，对照组加入等体积的试剂，培养24小时后，取出96孔培养板，弃去培养液并用PBS清洗，加入含MTT(终质量浓度为5g/L)的RPMI-1640培养液100μL，继续培养细胞4h后，弃去培养液，每孔加100μL二甲基亚砜，摇床振荡溶解结晶物。用DMSO调零，于490nm测定每孔OD值。按下述公式计算抑制率，并用直线回归法计算各多肽的IC50值。增殖抑制率(％)＝(1-给药组OD值/对照组OD值)×100％3、细胞侵袭实验检测多肽对HepG2侵袭能力的影响取4℃预冷的Matrigel胶和无血清RPMI-1640细胞培养液，按体积比1：4充分混合均匀。向Transwell板上室中每孔加入30μL上述混合液，覆盖室中整个聚碳酸酯膜，于37℃培养箱中静置3h后，每孔加入100μL细胞悬液(细胞密度为1×105/mL)和200μL无血清RPMI-1640培养液；同时向Transwell板下室每孔加入500μL含体积分数30％胎牛血清的RPMI-1640培养液。然后，用0、4、8、16、32、64μM的多肽分别处理HepG2细胞24h，然后取出小室，吸去培养液，甲醇固定30min，结晶紫染色20min，将小室倒置，用LeicaDC300F正置显微镜进行观察并拍照。选取小室底面上、下、左、右及中心5个视野计数细胞，计算侵袭率。实验重复3次，每个实验点10个复孔。4、RT-PCR检测多肽对HepG2细胞中MACC1mRNA表达的影响将HepG2细胞消化计数后加入6孔板，细胞密度为5×104/mL，细胞贴壁后，加入8、32μM的多肽培养24h，收集细胞，测定HepG2细胞中MACC1mRNA表达。另设置对照组，对照组不添加多肽。提取细胞总RNA，逆转录得cDNA，以此为模板进行PCR。引物如下：MACC1上游引物：5’-CCTTCGTGGTAATAATGCTTCC-3’MACC1下游引物：5’-AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT-3’β-actin上游引物：5’-ACGCACCCCAACTACAACTC-3’β-actin下游引物：5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGA-3’于无菌无酶PCR管中配制50μL反应体系，反应条件为94℃60s，60℃50s，72℃90s，40次循环后，72℃延伸10min；4℃保存以备20g/L琼脂糖凝胶电泳。实验重复3次。5、Westernblot检测多肽对He本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MACC1基因的多肽抑制剂，该多肽包含式(Ⅱ)氨基酸序列：ETLGQPDAK(Xa)PCFQEDPMA(Xb)GTDELGCMIWN；  (Ⅱ)其中，Xa和Xb选自M,Y,L,V,W或E。

【技术特征摘要】
1.一种MACC1基因的多肽抑制剂，该多肽包含式(Ⅱ)氨基酸序列：ETLGQPDAK(Xa)PCFQEDPMA(Xb)GTDELGCMIWN；(Ⅱ)其中，Xa和Xb选自M,Y,L,V,W或E。2.根据权利要求1所述的多肽抑制剂，其特征在于：Xa和Xb选自M或W。3.根据权利要求2所述的多肽抑制剂，其特征在于，该抑制剂为下述多肽之一：ETLGQPDAKMPCFQEDPMAMGTDELGCMIWN；ETLGQPDAKWPCFQEDPMAWGTDELGCMIWN；ETLGQPDAKMPCFQEDPMAWGTDELGCMIWN；ETLGQPDAKWPCFQEDPMAMGTDELGCMIWN。4.根据权利要求3所述的多肽抑制剂，其特征在于：多肽N和/或C末端被化学修饰。5.根据权利要求4所述的多肽抑制剂，其特征在于：所述多肽的N末端被乙酰化修饰，C末端被酰胺化修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，孙天娇，李岩，
申请(专利权)人：南京盖斯夫医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32