一种乌拉尔醇在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乌拉尔醇在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用。本发明专利技术发现乌拉尔醇具有促进hASCs成骨分化的作用，可以用于体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化，用于制备促进人脂肪间充质干细胞成骨分化体外培养基。

【技术实现步骤摘要】
一种乌拉尔醇在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用
本专利技术属于生物领域，涉及干细胞体外诱导分化，具体涉及一种乌拉尔醇在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用。
技术介绍
组织工程技术已成为骨缺损修复最有前途的治疗方法之一。人脂肪间充质干细胞(hASCs)作为间充质干细胞的一个重要来源，在骨组织工程中受到广泛关注。利用诱导剂体外培养hASCs促进其定向分化是获得骨组织工程细胞的重要途径。但是，目前这类诱导剂较少。乌拉尔醇(Uralenol，CAS登录号：139163-15-8)为一种较为常见的化合物，在多种植物中均存在，其化学结构如下：
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种乌拉尔醇在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用。实现本专利技术上述目的技术方案如下：一种乌拉尔醇在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用。一种乌拉尔醇在制备体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化的培养基方面的应用。一种乌拉尔醇体外培养hASCs促进其向成骨细胞分化进而获得骨组织工程细胞用于治疗骨组织疾病的用途。本专利技术的突出优点：本专利技术发现乌拉尔醇具有促进hASCs成骨分化的作用，可以用于体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化，用于制备促进人脂肪间充质干细胞成骨分化体外培养基。附图说明图1为倒置显微镜观察的hASCs细胞形态；图2中A为茜素红染色图；B为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；C为hASCs总蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本专利技术的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验材料L-DMEM培养基购自Thermo，胎牛血清购自GIBCO。双抗、茜素红购自Sigma，Trizol试剂购自Invitrogen，M-MLV逆转录酶购自TaKaRa。乌拉尔醇购自宝鸡市辰光生物科技有限公司，纯度98％。二、实验方法1、hASCs分离培养和鉴定将皮下脂肪抽吸液装入离心管，加入适量Ⅰ型胶原酶于37℃恒温摇床消化1h，加入等体积L-DMEM培养基终止消化，1500r/min离心10min，弃上清。将沉淀用适量L-DMEM培养基吹打混匀，200目网过滤，收集滤液，1000r/min离心5min，弃上清。将沉淀用适量含10％胎牛血清和1％双抗的L-DMEM培养基吹打混匀，转入细胞培养瓶中，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养、传代。倒置显微镜观察细胞形态。2、hASCs分组和诱导培养将生长状态良好的第3代hASCs分成对照组和诱导组，对照组使用含10％胎牛血清和1％双抗的L-DMEM培养基培养，诱导组使用含20μg/mL乌拉尔醇、10％胎牛血清和1％双抗的L-DMEM培养基培养。3、茜素红染色法鉴定成骨分化将生长状态良好的第3代hASCs，用含10％胎牛血清和1％双抗的L-DMEM培养基制成细胞悬液，以5×103/cm2的密度接种于24孔板中，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，待其生长至80％融合时，按照上述分组更换培养基继续培养，每3d更换一次培养基。培养12d后，弃去培养基，PBS洗涤，用40g/L多聚甲醛室温固定10min，1g/L茜素红染色工作液室温染色30min，PBS洗涤，倒置显微镜下观察钙沉积情况并拍照。4、RT-PCR法鉴定成骨分化将生长状态良好的第3代hASCs，用含10％胎牛血清和1％双抗的L-DMEM培养基制成细胞悬液，以5×103/cm2的密度接种于24孔板中，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，待其生长至80％融合时，按照上述分组更换培养基继续培养，每3d更换一次培养基。培养12d后，弃去培养基，PBS洗涤，用Trizol试剂抽提hASCs内总RNA，应用M-MLV逆转录酶试剂盒将RNA转化为cDNA，然后进行PCR反应，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶成像系统观察比较各组成骨标志基因RUNX2和OCNmRNA表达情况，内参基因为β-actin。5、Westernblotting法鉴定成骨分化将生长状态良好的第3代hASCs，用含10％胎牛血清和1％双抗的L-DMEM培养基制成细胞悬液，以5×103/cm2的密度接种于24孔板中，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，待其生长至80％融合时，按照上述分组更换培养基继续培养，每3d更换一次培养基。培养12d后，弃去培养基，PBS洗涤，以裂解液提取总蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒测量蛋白浓度。各组取等量总蛋白上样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后，取出分离胶，利用电转仪将分离胶上的蛋白转至PVDF膜上。用含有5％BSA的封闭液室温封闭2h，加入抗RUNX2、OCN、GAPDH一抗，4℃摇床过夜，加入HRP标记的二抗室温孵育1h，化学发光法显色，凝胶成像。三、实验结果1、hASCs分离培养和鉴定细胞形态观察结果如图1所示，细胞呈长梭形，旋涡状分布，符合hASCs生长特点。2、茜素红染色茜素红染色结果如图2中A所示，与对照组相比，诱导组可见明显的钙质沉积，钙质沉积是成骨细胞才有的特征，说明诱导组hASCs出现了明显的成骨分化。3、RT-PCR、Westernblotting结果RT-PCR和Westernblotting结果分别如图2中B、C所示，与对照组相比，诱导组RUNX2mRNA/蛋白、OCNmRNA/蛋白表达水平显著升高，而RUNX2和OCN是重要的成骨标志基因/蛋白，说明诱导组hASCs出现了明显的成骨分化。综上可见，乌拉尔醇具有促进hASCs成骨分化的作用，可以用于体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化，用于制备促进人脂肪间充质干细胞成骨分化体外培养基。上述实施例是对本专利技术实质性内容的体现，用于更好地解释本专利技术，但本领域技术人员应当知晓，不应将本专利技术的保护范围局限于上述具体的实施例。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乌拉尔醇在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种乌拉尔醇在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用。


2.一种乌拉尔醇在制备体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭守山，郭守河，
申请(专利权)人：南京盖斯夫医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32