一种促进肌肉干细胞增殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进肌肉干细胞增殖的方法，属于细胞培养和生物技术领域。本发明专利技术设计了体外有效扩增肌肉干细胞的培养基，包括L‑抗坏血酸、D‑抗坏血酸和/或胰岛素样生长因子‑I。应用本发明专利技术优化的培养基培养的肌肉干细胞培养21天后，总细胞数量增加超过10

【技术实现步骤摘要】
一种促进肌肉干细胞增殖的方法
本专利技术涉及一种促进肌肉干细胞增殖的方法，属于动物细胞培养和生物

技术介绍
肌肉干细胞又称肌卫星细胞，是位于肌肉组织基膜和肌细胞膜之间的一类单核干细胞。它是肌肉组织生长发育和损伤修复过程中最关键的祖细胞，当肌肉受到损伤时，处于静息状态的卫星细胞会被激活，开始迅速大量增殖，并可以启动分化程序，最终分化、融合形成新的肌管细胞，使骨骼肌得以快速地修复和再生。另外，卫星细胞还可以分化为成骨细胞和脂肪细胞等，能够为新生肌肉提供营养和稳定的支持，增加新生肌肉脂肪的含量，从而提高肌肉损伤修复效。骨骼肌再生障碍是多种疾病类型如肌肉萎缩、糖尿病、癌症等疾病的常见并发症，也是衰老、肥胖、宇航员等人群的常见生理现象，这类患者和人群的肌肉组织功能、结构形态、生化指标发生一系列变化，肌肉重量减轻、力量减弱，严重影响了个体的活动状态，甚至危及生命健康。利用干细胞治疗骨骼肌再生障碍疾病是临床上一种新兴、有效的治疗策略，具体指通过移植肌肉干细胞到患者体内，补充肌肉干细胞的数量并重建肌纤维，进而达到修复受损肌肉组织的目的。此外，近年来新提出的细胞培养肉概念，就是利用肌肉干细胞作为种子细胞，遵循肌肉组织的生长发育和损伤修复规律，在体外进行肌肉干细胞的培养，促进其增殖和分化，生产出人造肌肉组织，是一种颠覆传统农业系统的新兴肉类生产方式。无论是干细胞治疗还是细胞培养肉领域，肌肉干细胞数量不足的问题一直是限制其大规模应用的重要因素。肌肉干细胞在体内的数量极其稀少，需要通过组织分离提取肌肉干细胞，对其在体外进行大量扩增，获得大量具有成肌分化功能的肌肉干细胞，这是实现移植治疗或细胞培养肉制造目的最关键的一步。目前现有的细胞培养技术通过在含血清培养基中添加生长因子、小分子化合物等维持肌肉干细胞体外生长和增殖，培养方法的优化大多是利用小鼠的细胞作为对象进行研究的。但是，已有研究表明，小鼠和人的肌肉干细胞在特性上存在差异，如CD34是小鼠肌肉干细胞特征表明标志物，但是人的肌肉干细胞是不表达CD34的。目前从研究报道来看，猪、牛等大动物的肌肉干细胞和人肌肉干细胞的形态特征、表面标志物等十分类似。此外，在肌肉干细胞体外增殖策略的研究中，如果保持肌肉干细胞的干性是必须解决的关键科学问题。常规的培养方法虽然可以使肌肉干细胞在体外扩增，但是扩增过程中肌肉干细胞的干性维持能力会大幅下降，具体表现为Pax7蛋白的表达比例和分化成肌管的效率均从第0天90％以上，培养5～7天后下降为30％以下，也就是所谓的肌肉干细胞的无效扩增，对临床移植治疗和细胞培养肉的制造十分不利。开发促进肌肉干细胞增殖以及干性维持的培养方法，实现肌肉干细胞的有效扩增，对肌肉干细胞的大规模培养用于临床治疗和细胞培养肉生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供肌肉干细胞的体外培养方法，所述方法是用含(a)和/或(b)的培养基培养肌肉干细胞：(a)终浓度为：20～500uML-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I(IGF-1)；(b)终浓度为：20～500uML-抗坏血酸，10～300uMD-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I。在一种实施方式中，所述方法包括：(1)应用含(a)的培养基培养PAX7+肌肉干细胞，培养期间更换2-3次新鲜的含(a)的培养基；可选地，在起始后第3±0.5天，更换1次新鲜的含(a)的培养基；(2)培养起始后第11～13天，将培养基更换为含(b)的培养基，培养期间更换2-3次新鲜的含(b)的培养基；可选地，在起始后第14～16天，更换1次新鲜的含(b)的培养基。在一种实施方式中，在培养起始后第19～21天，终止培养，收获肌肉干细胞。在一种实施方式中，所述肌肉干细胞的来源包括但不限于人、猪、牛、兔或禽类。本专利技术的第二个目的是提供组合物A或组合物B在单独或共同用于制备促进肌肉干细胞扩增的产品中的应用；其中：组合物A：20～500uML-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I；组合物B：20～500uML-抗坏血酸，10～300uMD-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I。在一种实施方式中，所述组合物A：50～300uML-抗坏血酸，20～150ng/mLIGF-1。在一种实施方式中，所述的组合物A：100～200uML-抗坏血酸，50～100ng/mLIGF-1。在一种实施方式中，所述的培养基为含有胎牛血清(FBS)的DMEM培养基。在一种实施方式中，胎牛血清在培养基中的体积浓度为5％～20％。在一种实施方式中，胎牛血清在培养基中的体积浓度为10％。在一种实施方式中，所述肌肉干细胞的来源包括但不限于人、猪、牛、兔或禽类。在一种实施方式中，所述的肌肉干细胞是猪肌肉干细胞。本专利技术还提供一种用于肌肉干细胞有效扩增的试剂盒，所述的试剂盒中包括组合物A或组合物B；其中：组合物A：20～500uML-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I；组合物B：20～500uML-抗坏血酸，10～300uMD-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I。含有组合物A或组合物B的培养基，其中：组合物A：20～500uML-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I；组合物B：20～500uML-抗坏血酸，10～300uMD-抗坏血酸，10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I。在一种实施方式中，所述的培养基为含有胎牛血清、组合物A的DMEM培养基。在一种实施方式中，所述的培养基为含有胎牛血清、组合物B的DMEM培养基。本专利技术的有益效果：本专利技术设计了体外有效扩增肌肉干细胞的培养基，不仅可以大量获得可供基础研究的肌肉干细胞，更重要的是可以满足肌肉干细胞临床移植需要和构建用于细胞培养肉制备的种子细胞库。目前的肌肉干细胞扩增方法实现了其扩增，但在干细胞的分裂过程中，一个子细胞保留干性，但另一个则向下游分化，因此扩增后保持干性的细胞数量大大下降，即无效扩增。本专利技术使用含有L-抗坏血酸、D-抗坏血酸、IGF-1的扩增肌肉干细胞的配方来有效扩增肌肉干细胞，与传统方法相比，具有以下优势：促进肌肉干细胞的有效增殖，培养21天总细胞数量增加超过106倍，Pax7+细胞比例仍超过60％；经扩增后的肌肉干细胞能够经诱导分化形成大量典型的肌管，表达肌纤维特异性蛋白MyHC和Actin。实现了肌肉干细胞的有效扩增，对肌肉干细胞的大规模培养用于制备干细胞移植物和细胞培养肉生产具有重要意义。附图说明图1为肌肉干细胞扩增9天后细胞显微镜照片。图2为肌肉干细胞扩增不同时间总细胞数量(A)和培养第21天Pax7+细胞比例(B)。图3为EdU实验检测细胞增殖能力；A对照组；B实验组。图4为分化后Desmin免疫荧光染色情况；A对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肌肉干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述方法是用含(a)和/或(b)的培养基培养肌肉干细胞：/n(a)终浓度为：20～500uM L-抗坏血酸和10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I；/n(b)终浓度为：20～500uM L-抗坏血酸、10～300uM D-抗坏血酸和10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I。/n

【技术特征摘要】
1.肌肉干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述方法是用含(a)和/或(b)的培养基培养肌肉干细胞：
(a)终浓度为：20～500uML-抗坏血酸和10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I；
(b)终浓度为：20～500uML-抗坏血酸、10～300uMD-抗坏血酸和10～200ng/mL胰岛素样生长因子-I。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)第一阶段：应用含(a)的培养基培养肌肉干细胞至少10天，培养期间更换2-3次新鲜的含(a)的细胞培养基；
(2)第二阶段：将细胞在含(b)的细胞培养基中继续培养9～11天。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)在培养起始后第2～4天，更换一次新鲜的含(a)的培养基。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)在培养起始后第11～13天，将细胞培养基更换为含(b)的培养基，在培养起始后第14～16天，更换一次新鲜的含(b)的培养基。


5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述的培养基为含有胎牛血清的DMEM培养基。


6.组合物A、组合物B在单独或共同用于制备促进肌肉干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，关欣，方佳华，雷庆子，陈坚，堵国成，余世琴，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32