一种狂犬病毒抑制多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种狂犬病毒抑制多肽，序列为PPDVHTPPHALWRLHLILRVELVRMWWH，属于生物化学和分子生物学领域。本发明专利技术利用QSAR方法优化多肽后，与穿膜肽构成融合肽，在胞内发挥抑制病毒复制的作用。本方法特异性高、易操作，适用于入胞后狂犬病毒的控制。

Rabies virus inhibiting polypeptide, preparation method and application thereof

The invention provides a rabies virus inhibiting polypeptide, which has a sequence of PPDVHTPPHALWRLHLILRVELVRMWWH, and belongs to the field of Biochemistry and molecular biology. The invention optimizes the polypeptide after the QSAR method, and forms a fusion peptide with the membrane penetrating peptide, and plays the role of inhibiting the replication of the virus in the cell. The method is high in specificity and easy to operate, and is suitable for the control of rabies virus after entry into the cell.

【技术实现步骤摘要】
一种狂犬病毒抑制多肽及其制备方法和应用
本专利技术属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种狂犬病毒抑制多肽及其制备方法和应用。
技术介绍
狂犬病暴露后及时有效地处理是防治的关键，特别是狂犬病毒灭活疫苗和狂犬病毒抗体的联合使用，是WHO推荐的人狂犬病暴露后预防的唯一选择。即利用免疫手段使病毒在进入细胞前就被消灭。一旦处理不及时，病毒就会入侵细胞，狂犬病的防治也就失去了最佳时机，从而造成严重后果。因为目前对胞内狂犬病毒的控制还没有行之有效的方法。利用siRNA技术抑制胞内狂犬病毒的复制是一种很有前景的新方法，通过破坏或沉默病毒关键基因的表达，达到控制病毒复制的目的，该方法操作简单，效率高，毒性低，不足之处是缺乏安全、高效的胞内运输系统。磷蛋白是狂犬病毒的一种多功能蛋白，在致病过程中具有重要作用。作为一个必要中间体，通过与L蛋白和N蛋白结合，形成转录/复制复合体，参与病毒的转录和复制；除此之外，还可与宿主细胞的许多成分相互作用，如通过抑制IRF3和STAT1的活性，破坏宿主的先天免疫反应；通过与PML蛋白结合，破环宿主的抗病毒机制等。因此磷蛋白是狂犬病防治的重要靶分子。RealE等采用酵母双杂交系统从肽库中筛选出一组多肽，可与磷蛋白结合从而干扰转录/复制复合物的形成，并通过细胞内表达验证了其对病毒复制的抑制作用，为狂犬病毒抑制剂的开发提供了重要的先导物。但其活性还有待进一步提高，而且作为多肽药物，胞内给药的方法仍然没有解决。针对以上问题，设计出高活性、细胞透性好的多肽对于胞内病毒的防治十分重要。定量构效关系研究(quantitativestructure-activityrelationships，QSAR)是多肽分子优化设计的常用方法，通过对一系列多肽的结构或理化性质的定量描述，并借助数学和统计学方法确定化学结构与生物活性之间的关系，在此基础上进行新肽分子的活性预测和高活性肽的设计。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种狂犬病毒抑制多肽，并通过对多肽序列的优化达到提高病毒抑制效果的目的。一种狂犬病毒抑制多肽，多肽序列如SEQIDNo.45所示：PPDVHTPPHALWRLHLILRVELVRMWWH。进一步地，为实现胞内给药，在胞内抑制狂犬病毒的复制，在所述狂犬病毒抑制多肽的N端连接一段穿膜肽序列，所述穿膜肽序列可采用已知具备穿过细胞膜能力的短肽。更进一步地，所述穿膜肽序列为RRRRRRRRR，添加了穿膜肽的狂犬病毒抑制多肽序列如SEQIDNo.51所示：RRRRRRRRRPPDVHTPPHALWRLHLILRVELVRMWWH。上述狂犬病毒抑制多肽的序列设计方法，采用QSAR方法，具体步骤如下：(1)从已发表的文献中搜集已被证实能抑制狂犬病毒复制的多肽数据用于建模，共计29条多肽，序列信息如SEQIDNo.1-29所示；(2)通过PROFEAT服务器计算获得29条多肽的描述符变量(http://bidd2.nus.edu.sg/cgi-bin/profeat2016/main.cgi)，分别选择G3、G4、G5、G9四种描述符组合进行计算；采用遗传算法(Geneticalgorithm，GA)筛选与多肽生物活性直接相关的理化参数，参数设置为：初始群体大小100、最大遗传代数100、变异概率0.5％；(3)采用偏最小二乘法(Partialleastsquares,PLS)建立QSAR模型，分别用Kennardstone、Euclidean距离及基于活性分组方法将样本集分为训练集和测试集，用R2、Q2、和Q2ext统计量评价模型的质量，R2＞0.5、Q2＞0.5且Q2ext＞0.5时认为建模成功，作为后续分析基础；(4)从训练集或测试集中选择活性值较高的多肽作为出发肽进行优化设计，进一步提高其活性，分别对出发肽的每个氨基酸残基进行单点突变，并计算突变肽序列的描述符，选择与训练集相同的描述符变量G3、G4、G5、G9进行活性预测，活性高于出发肽的序列将是潜在的优化多肽，可通过实验进一步进行筛选和活性验证。进一步地，上述狂犬病毒抑制多肽序列通过固相合成法或体外重组表达获得。本专利技术还提供了上述狂犬病毒抑制多肽在抑制狂犬病毒胞内复制中的应用。进一步地，所述应用的剂量为12.5-50μg/ml培养液。本专利技术的优点：1.本专利技术将QSAR法应用于多肽的筛选及优化设计，具有快速方便、针对性强、效率高的特点，可快速获得活性提高的多肽序列。2.本专利技术利用穿膜肽递送药物解决了多肽药物入胞难的问题。3.本专利技术的狂犬病毒抑制多肽在胞内发挥了抑制病毒复制的作用，抑制效果明显，适用于狂犬病毒入胞后的处理，为入胞后病毒的控制提供了新的选择。4.本专利技术的优化肽可作为先导物设计抑制病毒胞内复制的小分子化合物。附图说明图1带穿膜肽的出发肽质谱图；图2带穿膜肽的优化肽质谱图；图3实施例2出发肽及优化肽对狂犬病毒的抑制效果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下述实施例中所用到的BSR细胞、CVS毒株均由深圳市卫光生物制品股份有限公司提供。实施例1通过QSAR对狂犬病毒抑制多肽序列进行优化设计(1)从已发表的文献(RealE,RainJC,BattagliaV,JalletC,PerrinP,TordoN,ChrismentP,D'AlayerJ,LegrainP,JacobY.Antiviraldrugdiscoverystrategyusingcombinatoriallibrariesofstructurallyconstrainedpeptides.JVirol.2004Jul；78(14):7410-7.)中搜集已被证实能抑制狂犬病毒复制的多肽数据用于建模，共计29条多肽，序列如表1所示：表1QSAR建模所用序列信息(2)通过PROFEAT服务器计算获得29条多肽的描述符变量(http://bidd2.nus.edu.sg/cgi-bin/profeat2016/main.cgi)，分别选择G3、G4、G5、G9四种描述符组合进行计算；采用遗传算法(Geneticalgorithm，GA)筛选与多肽生物活性直接相关的理化参数，参数设置为：初始群体大小100、最大遗传代数100、变异概率0.5％；(3)考虑到自变量可能存在多重相关性及样本个数少于变量个数情况，采用偏最小二乘法(Partialleastsquares,PLS)建立QSAR模型，为了验证模型的外部预测能力，分别用Kennardstone、Euclidean距离及基于活性分组方法将样本集分为训练集和测试集(见表1)，用R2、Q2、和Q2ext统计量评价模型的质量，R2≥0.998,Q2≥0.937，Q2ext≥0.852，建模成功，本实施例中选择活性分组方法建立的模型作为后续分析基础；(4)选择活性值较高的SEQIDNo.18(活性为1.40)作为出发肽进行优化设计，进一步提高其活性。分别对其序列中的28个氨基酸残基进行单点突变，并计算突变肽序列的描述符，选择与训练集相同的描述符变量G3、G4、G5、G9进行活性预测，经预测表2中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种狂犬病毒抑制多肽，其特征在于，多肽序列如SEQ ID No.45所示：PPDVHTPPHALWRLHLILRVELVRMWWH。

【技术特征摘要】
1.一种狂犬病毒抑制多肽，其特征在于，多肽序列如SEQIDNo.45所示：PPDVHTPPHALWRLHLILRVELVRMWWH。2.根据权利要求1所述的狂犬病毒抑制多肽，其特征在于，在所述狂犬病毒抑制多肽的N端连接一段穿膜肽序列。3.根据权利要求2所述的狂犬病毒抑制多肽，其特征在于，所述穿膜肽序列为RRRRRRRRR，添加了穿膜肽的狂犬病毒抑制多肽序列如SEQIDNo.51所示：RRRRRRRRRPPDVHTPPHALWRLHLILRVELVRMWWH。4.根据权利要求1-3任一所述的狂犬病毒抑制多肽，其特征在于，所述狂犬病毒抑制多肽序列通过固相合成法或体外重组表达获得。5.根据权利要求1所述的狂犬病毒抑制多肽的序列设计方法，采用QSAR方法，具体步骤如下：(1)从已发表的文献中搜集已被证实能抑制狂犬病毒复制的多肽数据用于建模，共计29条多肽，序列信息如SEQIDNo.1-29所示；(2)通过PROFEAT服务器计算获得29条多肽的描述符变量，分别选择G3、G4、G5、G...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢永忠，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37