疫苗制造技术

本发明专利技术涉及可模拟不可分型流感嗜血杆菌之Ｐ５样菌毛蛋白的抗原性的肽及其与至少一种Ｔ细胞表位的嵌合多肽，它们的编码ＤＮＡ，包含它们的宿主细胞，它们的产生方法，用它们制备的疫苗组合物，以及它们在流感嗜血杆菌病的预防和检测中的应用。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新鉴定的肽和编码这些肽的多核苷酸以及携带这些肽的嵌合蛋白。本专利技术还涉及一种用于分离这些肽或嵌合蛋白的方法和用于治疗流感嗜血杆菌感染的疫苗组合物。
技术介绍
流感嗜血杆菌(Hi)是一种革兰氏阴性球杆菌和严格的人类共生体。流感嗜血杆菌菌株(Hi)或是包裹在多糖内荚膜或是没有荚膜，因而也就相应地分为可分型的(有荚膜)和不可分型的(没有荚膜)菌株。带有荚膜的致病原流感嗜血杆菌(Hi)主要，但并非唯一地导致六岁以下儿童的侵袭性疾病。例如，流感嗜血杆菌b型(Hib)是在儿童中引发脑(脊)膜炎和其它侵袭性疾病的一个主要原因。抗Hib感染已经有了有效的疫苗，它以产生多糖荚膜的抗体为基础，并因而对不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)引发的感染无效。不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)是主要定居菌株而且，尽管鲜有侵袭性，但是它仍是绝大多数粘膜疾病，包括中耳炎、窦炎、慢性结膜炎和慢性下呼吸道感染或其恶化的原因。目前，大约30％，最多62％的ntHi具有青霉素抗性。带菌状态在儿童中估计占44％，在成年人中约占5％，并能持续数月。但是由ntHi引发的中耳炎无论致病机理，还是宿主免疫反应，现在均没有完全弄清楚。中耳炎是两岁以下儿童中的较常见疾病。患者在中耳处有流体的出现并伴随有急性的局部或全身性疾病的征兆。急性的征兆包括耳痛、耳干、听力丧失而全身性症状有发热、无力、兴奋、厌食、呕吐或腹泻。肺炎链球菌和不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)是导致该症状的最主要细菌，大约分别占所培养细菌的25-50％和15-30％。另外，ntHi引起53％的复发性中耳炎。1岁和3岁的儿童分别有大约60％和80％有该病的至少一种症状(峰值约为10个月)。已有证据表明，对ntHi存在保护性免疫。然而，表位的抗原漂移(外膜蛋白P2,P4,P6)在ntHi逃避宿主免疫防御的能力上扮演着重要的角色。因此，需要另外一种有效的抗流感嗜血杆菌的疫苗，尤其抗无荚膜流感嗜血杆菌的疫苗，其不受当前应用的Hi多糖疫苗的影响。菌毛是发现于ntHi表面的附属物，在慢性中耳炎儿童的中耳和鼻咽处收获的细菌中100％有菌毛。包含菌毛蛋白(一种衍生自ntHi的菌毛的丝状蛋白)的疫苗已有报道(WO 94/26304)。菌毛蛋白和ntHi外膜蛋白P5同源，此P5蛋白已经成为另一项专利申请的主题(EP680765)。P5样蛋白这种菌毛蛋白能诱导产生和细菌表面发生相互作用的抗体并为杀菌性蛋白(WO94/26304)。该蛋白已经纯化并显示出能够诱导针对各种不同的ntHi的免疫反应。从细菌外膜分离菌毛蛋白的现有方法既烦琐又耗时。一种在其它种细菌中使用的策略是生产天然蛋白的相对较短的线性肽。然而这种方法使用价值有限，因为这类改变的免疫原的抗体常常不能识别天然病原体。LB1(f)是一个有19个氨基酸的肽(SEQ ID NO:5)，它衍生自菌株ntHi1128上P5样菌毛蛋白的序列(占据117位精氨酸到135位甘氨酸之间的区段)。该肽最初通过分析P5样菌毛蛋白的一级序列而鉴定为潜在的B细胞表面表位。用包括LB1(f)肽、连接肽和T细胞表面表位的菌毛蛋白嵌合肽(称为LB1肽)免疫动物，可诱导针对P5样菌毛蛋白的免疫应答和减少动物接触ntHi后ntHi的体内定居(见US5,843,464),LB1肽在体内具有免疫原性，其抗血清可与变性的或天然的菌毛蛋白发生免疫应答。因此该肽可作为有效的免疫原，因为它能产生识别并结合其天然结构上的表位的抗体。这部分是由于合成的LB1(f)肽可以模拟菌毛蛋白中肽的卷曲螺旋型二级结构。在疫苗中仅使用一种流感嗜血杆菌的蛋白质抗原的问题是，保护作用可能很大程度上被限制在同源菌株的攻击上。ntHi外膜蛋白的抗原多样性意味着，开发针对ntHi异源性微生物的广谱有效疫苗需要新的策略。如下，本专利技术涉及LB1(f)肽作为疫苗的更有效应用，该疫苗是针对广泛的能表达P5样菌毛蛋白(或该蛋白的天然变体)的流感嗜血杆菌异源株。专利技术概述本专利技术的目的是提供各种ntHi菌株之P5样菌毛蛋白的新鉴定的抗原性亚单位肽(LB1(f)肽)。另一目的是提供携带这些肽并在动物体内诱导对ntHi的免疫应答的嵌合多肽、和编码这些肽或多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及分离这些肽或嵌合多肽的方法、在生物样品中检测这些肽存在的方法，以及在流感嗜血杆菌感染的治疗中应用的疫苗组合物。LB1(f)肽包含长约13到约22个氨基酸的多肽。这些肽可分为三组(其中一组包含2个亚组)。嵌合多肽包含共价结合至载运蛋白(其另可作为一种T细胞表位)的一或多个LB1(f)肽单位。该载运蛋白优选来自流感嗜血杆菌，使它也能诱导动物体内针对流感嗜血杆菌(包括不可分型的流感嗜血杆菌)的免疫原性应答。参考以下附图和详述可以更全面理解本专利技术。附图简述附图说明图1质粒pMGMCS。给出了多克隆位点的DNA序列。图2质粒pRIT 14588。图3质粒LPD-LB1-A。图4质粒LPD-LB1-Ⅱ。LB1(f)肽的1组(LB1-GR1)、2组(LB1-GR2)的DNA和氨基酸序列用箭头表示。这些箭头将LB1(f)肽包括在P5样菌毛蛋白中其天然的前后序列中。图5质粒LPD-LB1-Ⅲ。LB1(f)肽的1组(LB1-GR1)、2组(LB1-GR2)和3组(LB1-GR3)的DNA和氨基酸序列用箭头表示。这些箭头将LB1(f)肽包括在P5样菌毛蛋白中其天然的前后序列中。LB1(f)多肽(称为LPD-LB1(f)2,1,3)从第一位的甲硫氨酸延伸到终止密码子前的C-末端组氨酸残基。图6丙烯酰胺凝胶，经考马斯亮兰染色显示以下质粒的表达产物。泳道1．分子量标准 2．pMGMCS 3．pRIT145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(纯化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量标准图7丙烯酰胺凝胶的Western Blot(使用兔抗-LB1抗血清)显示以下质粒的表达产物泳道1．分子量标准 2．pMGMCS 3.pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(纯化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量标准图8丙烯酰胺凝胶的Western Blot(使用单克隆抗-LPD抗体)显示以下质粒的表达产物泳道1．分子量标准 2．pMGMCS 3．pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(纯化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量标准图9丙烯酰胺凝胶的Western Blot(使用含6个组氨酸的纯化标签的抗体)显示以下质粒的表达产物泳道1．分子量标准 2．pMGMCS 3．pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(纯化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量标准图10被动转移/攻击实验。通过对五个同龄组的被动免疫毛丝鼠进行超过35天的观察得出的平均鼓膜炎症指数。平均鼓膜炎症值1.5处的间断水平线表示仅由腺病毒引起的炎症。超过该水平线的值表示由ntHi引起的炎症。-安慰剂组；○-LB1；■-L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肽，其包含一或多个选自下组的氨基酸序列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３，和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４或上述序列的任何抗原相关变体，其同源性至少为７５％并能在免疫学上模拟不可分型流感 嗜血杆菌Ｐ５样菌毛蛋白的相关抗原决定位点，条件是该抗原相关变体不包括ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６所提供的多肽。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：劳伦O巴卡利茨，约瑟夫科恩，盖伊德奎斯尼，伊维斯洛贝特，
申请(专利权)人：史密斯克莱比奇曼生物公司，俄亥俄州大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]