一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法技术

一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法，本发明专利技术涉及检测、筛选及鉴定代谢生物标记物的方法。本发明专利技术是要解决现有技术不能确定肾阳虚证的生物标记物的问题，而提出的一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法。该方法是通过复制肾阳虚证大鼠模型；评价肾阳虚证大鼠模型；制备得到大鼠尿液或血液QC样本；得到尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物；大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定鉴定得到尿液生物标记物33个，血液生物标记物17个等步骤实现的。本发明专利技术应用于检测、筛选及鉴定代谢生物标记物领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法。
技术介绍
中医的藏象是“藏居于内，形见于外”，临床上则以“证”为表现。“证”本质是机体失衡而致的代谢或其网路的改变，该特征性表型是通过脏器分泌到血液或尿液中的内源性代谢成分(小分子代谢物)表达谱的改变而被客观地反映出来。而代谢组学正是研究机体受外界因素干扰后，其代谢产物(内源代谢物质)的种类、数量及其变化规律的科学。因此，代谢组学的兴起提供了一条从系统层面将多层次多维度数据进行整合分析的方法，用现代科学语言表述了中医药的特性。代谢组学以其整体、动态、重视整体功能变化等特点，与中医证候对病理状态的表达理念不谋而合。肾阳虚证是中医临床常见病证，也是影响现代人类健康的多种常见病的共性基础性病理，临床主要表现为畏冷肢寒、精神不振、头晕目眩、阳痿阴缩、夜尿频多、宫寒不孕等症状。因此补肾阳作用研究在防病治病方面具有重要意义。大量研究表明肾阳虚证可在下丘脑-垂体-靶腺轴、能量代谢、免疫系统、细胞信号系统、心脏和肾脏有不同程度的紊乱现象，是多种系统和器官功能的综合表现。其中，下丘脑-垂体-靶器官(肾上腺、性腺和甲状腺)轴的功能紊乱是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法，其特征在于，该方法具体是按照以下步骤进行的：步骤一、复制肾阳虚证大鼠模型；将正常组的每只清洁级大鼠皮下注射橄榄油溶液，将模型组的每只清洁级大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液；采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本、血液样本和脏器样本；步骤二、评价肾阳虚证大鼠模型；计算血清和尿液样本的各生化指标的相应浓度、大鼠体重数据、脏器指数以及免疫组织化学指标；根据各指标具有极显著性差异，确定复制的肾阳虚证大鼠模型以及皮质酮诱导的肾阳虚大鼠模型；步骤三、将大鼠原始浓度尿液制备得到大鼠尿液QC样本；将步骤一得到的采集正常组及模型组...

【技术特征摘要】
1.一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法，其特征在于，该方法具体是按照以下步骤进行的：步骤一、复制肾阳虚证大鼠模型；将正常组的每只清洁级大鼠皮下注射橄榄油溶液，将模型组的每只清洁级大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液；采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本、血液样本和脏器样本；步骤二、评价肾阳虚证大鼠模型；计算血清和尿液样本的各生化指标的相应浓度、大鼠体重数据、脏器指数以及免疫组织化学指标；根据各指标具有极显著性差异，确定复制的肾阳虚证大鼠模型以及皮质酮诱导的肾阳虚大鼠模型；步骤三、将大鼠原始浓度尿液制备得到大鼠尿液QC样本；将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本制备得到大鼠的尿液样本；步骤四、将大鼠原始浓度血液制备得到大鼠血液QC样本；将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的血液样本制备得到大鼠血液样本；步骤五、分别将步骤三得到的大鼠尿液QC样本和大鼠的尿液样本以及步骤四得到的大鼠血液QC样本和大鼠血液样本进行高效液相色谱柱梯度洗脱得到大鼠样本的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物；步骤六、将步骤五中计算得到的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物分别进行正离子扫描模式和正离子扫描模式下的质谱分析，得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息；步骤七、利用模式识别分析-主成分分析方法将步骤六得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息进行分析得到正常组大鼠尿液、模型组大鼠尿液、正常组大鼠血液以及模型组大鼠血液的代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图；步骤八、根据步骤七得到的正常组大鼠尿液与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定肾阳虚证大鼠尿液的代谢轮廓信息；步骤九、根据步骤七得到的正常组大鼠与模型组大鼠血液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图获得肾阳虚证大鼠血液的的代谢轮廓信息；步骤十、鉴定肾阳虚证潜在生物标记物，根据肾阳虚证大鼠尿液和肾阳虚证大鼠血液潜在生物标记物保留时间和质核比信息进行代谢物库的匹配；通过高效液相色谱以及质核比MS/MS数据来确定标记物的化学结构；共鉴定得到尿液生物标记物33个，血液生物标记物17个；所述33个尿液代谢物鉴定结果分别为：12-羟基十二烷酸、乙酰基-L-酪氨酸、N-乙酰血清素、黄尿酸、马尿酸、二碘羟基喹啉、氢化肉桂酸、牛磺酸、烟酰胺、11β，21-二羟基-5β-孕酮-3,20-二酮、肌酐、胸苷、胞嘧啶、3-甲醛吲哚、醛赖氨酸、犬尿酸、3-甲氧基肾上腺素、羟苯基乙酰甘氨酸、N-丁二酰-L-谷氨酸-半醛、L-缬氨酸、3-羟基十二碳二酸、泛酸、癸二酸、苯丙酮酸、尿酸、α-亚麻酸、苯乙酰甘氨酸、葡萄糖醛酸内酯、N-乙酰-L-精氨酸、酮戊二酸、尿囊素、N-乙酰神经氨酸、吡咯啉羧酸；所述17个血液代谢物鉴定结果分别为：9,12,15-十八碳三烯酸甲酯、皮质酮、亚麻酸、L-色氨酸、棕榈酰胺、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、PC(17:1(9Z)/0:0)、表脱氧胆酸、硫酸吲哚酚、棕榈酰肉碱、1-磷酸-鞘氨醇、尿苷、牛磺胆酸、PE(19:0/0:0)、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE(18:0/0:0)；其中，匹配原则：一级质量数结合质谱IDA采集得到的二级数据与代谢物库进行匹配。2.根据权利要求1所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法，其特征在于：在步骤一中，所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本具体为：(1)、将清洁级大鼠完全随机分成2组，即正常组和模型组；(2)、正常组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射橄榄油溶液，模型组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液，(3)、采集每只大鼠12h的尿样，将新鲜尿液样于4℃、13000rpm离心10min条件下在-80℃贮存，进行分析之前室温解冻。3.根据权利要求2所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法，其特征在于：在步骤一中，所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的血液样本具体为：1)每只大鼠均于腹主动脉采集血液，在离心4℃，4000r/min，10min条件下分离血清；2)分装后冻存于-80℃冰箱，进行分析之前室温解冻。4.根据权利要求1、2或3所述一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法，其特征在于：在步骤一中，所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的脏器样本具体为：①采集每只大鼠经腹主动脉血样后，迅速取出肾上腺、胸腺、睾丸并用分析天平称重，计算各脏器的脏器指数；②...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜军，张爱华，刘琦，周晓航，南洋，
申请(专利权)人：王喜军，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23