本发明专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及大叶藻微卫星标记及其筛选方法和应用。本发明专利技术提出一组适于大叶藻品种分类、遗传关系鉴定的微卫星标记；相应的，本发明专利技术还提供该组大叶藻微卫星标记的筛选方法，以及利用该组大叶藻微卫星标记对大叶藻基因型进行检测的方法。应用本发明专利技术的检测方法进行检测，对每对引物的PCR扩增产物进行分析，分辨准确率达100％；说明本发明专利技术的4个微卫星标记能用于大叶藻的品种分类、遗传关系鉴定；该检测方法简单易行，检验结果准确；通过简单水面采集叶片和实验室PCR检测鉴别大叶藻与丛生大叶藻样品，取代了繁重的潜水作业。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及大叶藻微卫星标记及其筛选方法和应用。
技术介绍
丛生大叶藻(Zostera caespitosa)是太平洋西北海岸特有的大叶藻属植物。山东半岛的大叶藻场主要由大叶藻(Zostera marina L)和/或丛生大叶藻二者共同构成。在这些海底草场中，丛生大叶藻覆盖面积与大叶藻相当，丛生大叶藻与大叶藻均为大叶藻属海草，较容易与同域分布的其他海草区分，但二者叶片形态特征相同，仅凭水面抓斗采集叶片样品，不能将二者分辨，目前只能通过科学潜水员水下观察鉴定。而大叶藻与丛生大叶藻在山东半岛草场中常常混生，为草场维护与研究带来了极大的困难。目前，国外研究人员积累的大量海底草场研究资料与生态修复经验，在排除丛生大叶藻的影响前，是不能应用于山东半岛大叶藻与丛生大叶藻的混生草场研究的。微卫星DNA是目前最常见的分子标记，其特异性强，检测准确而快速等特性使其检测结果在司法鉴定领域成为黄金标准，在其他动植物遗传学研究中微卫星DNA标记用途广泛，其中之一便是作为分辨特定物种(或品种)与其相似物种(或品种)的工具。
技术实现思路
本专利技术提供一组适于大叶藻品种分类、遗传关系鉴定的微卫星标记，并提供该组微卫星标记的筛选方法，以及利用该组大叶藻微卫星标记对大叶藻基因型进行检测的方法，该检测方法仅通过分析抓斗采集的叶片样本，就可在实验室内实现大叶藻与丛生大叶藻快速准确分辨。本专利技术人对目前全球广泛应用的23个大叶藻微卫星标记位点进行筛查，发现其中4个大叶藻微卫星标记位点在丛生大叶藻中普遍不存在，在PCR检测中结果为阴性；这4 个含有大叶藻微卫星标记的核苷酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。其中核苷酸序列SEQ ID NO 1的微卫星核心序列为GAGAGAGAGAGAGAGA ；核苷酸序列SEQID NO :2的微卫星核心序列为CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT ；核苷酸序列SEQ ID NO 3的微卫星核心序列为ATGGATGGATGGATGGATGG ；核苷酸序列SEQ ID NO 4的微卫星核心序列为AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG。本专利技术人对目前全球广泛应用的23个大叶藻微卫星标记位点进行筛查的具体方法如下针对这23个大叶藻微卫星标记位点分别设计对应的引物，利用23对引物分别扩增采集到的49个丛生大叶藻样品与57个大叶藻样品的相应片段，选择符合以下特性的引物(1)、在最佳退火温度下，所有大叶藻样品中全部有特异性目标产物，且产物条带清晰，信噪比高，无非特异性扩增条带。(2)、在最佳退火温度下，在全部丛生大叶藻中无PCR产物，背景清晰无噪音。依照上面方法，共筛选到四个微卫星标记位点，这四个含有微卫星标记的核苷酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。扩增这四个微卫星标记使用的引物是核苷酸序列SEQ ID NO 1 :F :CGAACATGAATCTCCGAACC，R :GGTAAATGCACCCAGCTCTC ；核苷酸序列SEQ ID NO 2 :F CCCCATCTTTTGAGTTTGGA, R TCATCATTTCTTGCAATTTGAATC ；核苷酸序列SEQ ID NO 3 :F CATTCCATTCAAGAGCAGCA, R CAACAAATCAATCAATCATTCACTC ；核苷酸序列SEQ ID NO 4 :F :AATCTGTTGCCACGAAGGAG，R :TCACCTTCATCAAGCAGTCG。本专利技术还提供利用大叶藻微卫星标记对大叶藻基因型进行检测的方法，具体方法如下首先提取大叶藻属基因组DNA并稀释备用；再利用大叶藻中含有的微卫星核心序列， 使用特异性引物对大叶藻不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳检测，从而确定大叶藻不同个体在微卫星标记核心序列区的基因型，其中大叶藻微卫星标记的特异性引物为核苷酸序列SEQ ID NO 1 :F :CGAACATGAATCTCCGAACC，R :GGTAAATGCACCCAGCTCTC ；核苷酸序列SEQ ID NO 2 :F CCCCATCTTTTGAGTTTGGA, R TCATCATTTCTTGCAATTTGAATC ；核苷酸序列SEQ ID NO 3 :F CATTCCATTCAAGAGCAGCA, R CAACAAATCAATCAATCATTCACTC ；核苷酸序列SEQ ID NO 4 :F :AATCTGTTGCCACGAAGGAG，R :TCACCTTCATCAAGCAGTCG。其中核苷酸序列SEQ ID NO 1用PCR扩增时的复性温度是55°C ；核苷酸序列SEQ ID NO :2用PCR扩增时的复性温度是59°C ；核苷酸序列SEQ ID NO :3用PCR扩增时的复性温度是61°C ；核苷酸序列SEQ ID NO 4用PCR扩增时的复性温度是64°C。优选地，提取的大叶藻属基因组DNA稀释为IOOng/ μ L。其中，所述提取大叶藻属基因组DNA的步骤为a、采集大叶藻属叶片样品；b、配制提取缓冲液I 在离心管中将2-5mL 2 X CTAB缓冲液和40-80 μ L β -巯基乙醇混勻，使用前65°C水浴预热；C、将大叶藻属叶片样品基部部分于液氮条件下迅速研磨至粉末状，将粉末迅速移至含有提取缓冲液I的离心管中，混勻，60-70°C条件下水浴30-60分钟，期间晃动几下；d、取出离心管冷却至室温，在IOOOOrpm转速下，室温离心10_20分钟；e、将上清液移取至另一离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物，氯仿和异戊醇的体积比是24 1，混勻10-15分钟，之后在IOOOOrpm转速下，室温离心10-20分钟； 重复一次本步骤；f、在离心管中加2/3体积的异丙醇，_20°C静置30分钟以上，在IOOOOrpm转速下， 4°C，离心10-20分钟；g、弃上清后，加入3ml 70%预冷的酒精缓慢颠倒洗涤沉淀，放置5_15分钟后，在 IOOOOrpm转速下，4°C离心10-20分钟；h、弃上清并吸干酒精，用100-500 μ L蒸馏水溶解，静置10分钟以上，后转入1. 5mLEP 管中；i、加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物，氯仿和异戊醇的体积比是24 1，抽提 10-15分钟，之后在IOOOOrpm转速下，室温离心10-20分钟；j、取上清，记录体积，加2/3体积的异丙醇和1/10体积的3-4mol/L醋酸钠，异丙醇和醋酸钠均预冷，混勻，-20°C静置30分钟以上；k、在IOOOOrpm转速下，4°C，离心10-20分钟，离心出沉淀，用ImL 75%的预冷酒精缓慢颠倒洗涤DNA，再在IOOOOrpm转速下，离心10分钟，弃酒精；1、重复j步骤一次；mjfDNA自然风干至无酒精挂壁，之后加100-500 μ L灭菌蒸馏水溶解，置4°C冰箱中保存，完成大叶藻属基因组DNA的提取。优选地，所述提取大叶藻属基因组DNA的步骤为A.采集大叶藻属叶片样品；B.配制提取缓冲液I 在离心管中将3mL 2 X CTAB缓冲液和60 μ L β -巯基乙醇混勻，使用前65 °C水浴预热；C.将大叶藻属叶片样品基部部分于液氮条件下迅本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．适于大叶藻品种分类、遗传关系鉴定的微卫星标记，其特征在于：所述的含有微卫星标记的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－４所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江鑫，彭捷，张立楠，崔翠菊，李晓捷，潘金华，韩厚伟，张壮志，罗世菊，付晓斌，张文枫，曹增梅，王静，
申请(专利权)人：山东东方海洋科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。