【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种海带育种方法及应用方法。具体是一种多倍体杂交海带的培育方法及应用方法，属于水产工程遗传育种领域。
技术介绍
1、海带多倍体诱导及育种技术的研究为改良海带经济性状提供了更多的可能。多倍体诱导方法有利用体细胞全能性的物理诱导，有利用药物刺激的化学诱导等多种方法。自然界中常见的野生海带多为二倍体，目前海带育种工作所培育的生产品种也都是二倍体。利用组织培养方式，发挥海带体细胞全能性可以诱导不同品种（系）海带获得海带丝状体。这种通过体细胞诱导获得的海带丝状体和通过海带孢子囊放散游孢子发育成的海带配子体均可以进行杂交并发育成孢子体。植物细胞全能性，指的是植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。由海带体细胞诱导得到的二倍体丝状体其细胞核中含有两套染色体。
2、传统二倍体杂交海带的培育方法是用分别由游孢子发育来的单倍体雌配子体和单倍体雄配子体组合杂交，获得的是二倍体的海带孢子体。
3、现有技术中尚没有利用不同品种（系）诱导丝状体杂交组合获得四倍体杂交海带孢子体的报道。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种四倍体杂交海带的培育方法及应用，第一、用不同海带品种（系）诱导获得的不同品种（系）海带二倍体丝状体经性别分组选出2n♀和2n♂进行组合杂交，获得了四倍体的杂交海带；第二、获得由游孢子发育而来的二倍体的配子体。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种四倍体杂交海带的培育方法
4、第一步：海带二倍体丝状体的制备
5、（1）不同品种或不同品系海带二倍体丝状体的诱导
6、将不同品种或不同品系海带幼孢子体外植体分别放置在培养皿中，加入pesi培养液，然后在光照培养箱中进行培养；所述pesi培养液前两个月每7～10天更换一次；第3～4个月每15～30天更换一次；之后每50～60天更换一次，直至显微镜下能够看到在海带外植体周围有褐色的丝状体团；
7、（2）海带二倍体丝状体的扩培
8、将培养出的海带丝状体团分别用灭菌刀片由海带幼孢子外植体剥离，切成多个细胞团转入培养皿中，放入光照培养箱中进行扩大培养，培养基采用pesi培养液；所述pesi培养液每8～12天更换一次；分别培养至所需生物量；
9、第二步：四倍体杂交海带的培育
10、（1）亲缘关系及倍性鉴定
11、用分子生物学手段鉴定诱导获得的丝状体与亲本的亲缘关系，确定获得的丝状体来自所用亲本；用流式细胞仪法鉴定诱导获得的丝状体，确认获得的丝状体倍性为二倍体；
12、（2）镜检选择
13、在显微镜下进行选择，选择其中直径在9um≤φ≤20um范围内达到95%以上的海带二倍体丝状体作为母本，选择其中直径在4um≤φ＜9um范围内达到95%以上的海带二倍体丝状体作为父本；
14、（3）不同品种或不同品系海带二倍体丝状体杂交组合获得四倍体杂交海带
15、将所述母本与父本进行杂交，经过培育获得四倍体的杂交海带。
16、优选地，所述在光照培养箱中进行培养的条件是：培养温度为13℃～17℃，光照强度为30～40µmol/m2·s，光周期为每日10～12h光照。
17、优选地，所述放入光照培养箱中进行扩大培养的条件是：培养温度为5～10℃，光照强度为20～30µmol/m2·s，每天24h光照。
18、所制备的四倍体杂交海带的应用：取成熟期四倍体杂交海带的孢子囊放散游孢子，经培养获得由游孢子发育而来的二倍体的雌雄配子体。
19、优选地，所述的应用按照以下步骤进行：
20、（1）剪取四倍体杂交海带成熟的孢子囊块，置于6-8℃的光照培养箱中避光阴干刺激2h-24h至孢子囊块表面没有水份；
21、（2）在n/p培养液中进行游孢子放散并进行镜检观察，待游孢子密度达到100×镜下每个视野有10~20个时停止放散；
22、（3）去除孢子囊块，将培养容器置于光照培养箱中培养；培养液每三天全量更换一次，并观察拍照，游孢子附着后形成胚孢子，胚孢子萌发发育形成配子体，至此获得由游孢子发育而来的二倍体的配子体。
23、进一步优选地，所述将培养容器置于光照培养箱中培养的培养条件是：培养温度为8~10℃，光照强度为30~40µmol/m2·s，光周期为每日10～12h光照、培养液选用n/p培养液。
24、优选地，所述n/p培养液由硝酸钠、磷酸二氢钾和灭菌海水组成。
25、相对于现有技术，本专利技术具备以下有益效果：
26、第一、申请人制备得到海带二倍体丝状体后，用分子生物学手段鉴定诱导获得的丝状体与亲本的亲缘关系，证明获得的丝状体来自所用亲本，流式细胞仪法鉴定丝状体倍性为二倍体，利用性别特异引物的pcr扩增结果鉴定二倍体丝状体中雌雄性别标记都有，镜检发现也是雌雄混合体。利用所述海带二倍体丝状体育种时偶然发现，与单倍雌配子体或者单倍雄配子体进行杂交获得三倍体时出苗量存在显著差异：有的品种（系）与单倍雌配子体杂交出苗量正常且明显高于与单倍雄配子体的杂交出苗量，而有的品种（系）与单倍雄配子体杂交出苗量正常且明显高于与单倍雌配子体的杂交出苗量。
27、经过多年的诱导丝状体育苗实验发现，上述现象的原因在于特定的品种（系）诱导的丝状体雌性（2n♀）占绝大多数，特定的另一品种（系）诱导的丝状体雄性（2n♂）占绝大多数。这种雌雄比例的悬殊导致诱导获得的海带丝状体在直接自交时出苗量极少，而选择这种诱导获得的丝状体雌性（2n♀）占绝大多数的品种（系）（雌性组）和雄性（2n♂）占绝大多数的品种（系）（雄性组）按常规育苗方法进行杂交，出苗量及规格均能达到商品苗的要求。
28、本专利技术用不同海带品种（系）诱导获得的二倍体丝状体经性别分组选出2n♀和2n♂进行组合杂交，获得了四倍体的杂交海带。
29、第二、本专利技术诱导不同品种（系）海带体细胞获得二倍体的海带丝状体，并进行不同品种（系）二倍体海带丝状体的雌雄杂交获得四倍体的海带孢子体。通过选优留种，由游孢子发育而来的二倍体的配子体，可以和不同倍性雌雄配子体杂交，为海带多倍体杂交育种提供新的方法，为选择海带优良品种提供了新的途径。
30、第三、取本专利技术所培育的四倍体杂交海带成熟的孢子囊放散游孢子，经培养可获得由游孢子发育而来的二倍体的配子体。这是本专利技术四倍体杂交海带培育出来的一个重要意义。也就是说，利用本专利技术培育的四倍体杂交海带能够获得由游孢子发育而来的二倍体配子体，其不同于本专利技术所用的体细胞诱导来的二倍体丝状体。
31、第四、本专利技术四倍体杂交海带的培育方法和传统二倍体杂交海带的培育方法不同，四倍体杂交海带的培育方法是用分别由海带体细胞诱导来的二倍体海带丝状体雌与二倍体海带丝状体雄杂交，获得的是四倍体的杂交海带，且获得的四倍体杂交海带在成熟期长孢子囊并放散游本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种四倍体杂交海带的培育方法，其特征在于按照以下步骤进行：
2.如权利要求1所述的四倍体杂交海带的培育方法，其特征在于所述在光照培养箱中进行培养的条件是：培养温度为13℃～17℃，光照强度为30～40µmol/m2·s，光周期为每日10～12h光照。
3.如权利要求1所述的四倍体杂交海带的培育方法，其特征在于所述放入光照培养箱中进行扩大培养的条件是：培养温度为5～10℃，光照强度为20～30µmol/m2·s，每天24h光照。
4.权利要求1或2或3所制备的四倍体杂交海带的应用，其特征在于：取成熟期四倍体杂交海带的孢子囊放散游孢子，经培养获得由游孢子发育而来的二倍体的雌雄配子体。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于按照以下步骤进行：
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述将培养容器置于光照培养箱中培养的培养条件是：培养温度为8~10℃，光照强度为30~40µmol/m2·s，光周期为每日10～12h光照、培养液选用N/P培养液。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述N/P培养液由硝酸钠、
...【技术特征摘要】
1.一种四倍体杂交海带的培育方法，其特征在于按照以下步骤进行：
2.如权利要求1所述的四倍体杂交海带的培育方法，其特征在于所述在光照培养箱中进行培养的条件是：培养温度为13℃～17℃，光照强度为30～40µmol/m2·s，光周期为每日10～12h光照。
3.如权利要求1所述的四倍体杂交海带的培育方法，其特征在于所述放入光照培养箱中进行扩大培养的条件是：培养温度为5～10℃，光照强度为20～30µmol/m2·s，每天24h光照。
4.权利要求1或2或3所制备的四倍体杂...
【专利技术属性】
技术研发人员：田萍萍，李言，刘延岭，李晓捷，孙娟，史良，梁广津，赵聚萍，赵楠，李霞，武瑞娜，
申请(专利权)人：山东东方海洋科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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