一种对生产二十二碳六烯酸隐甲藻进行基因转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产二十二碳六烯酸隐甲藻敏感的抗生素潮霉素B，以及利用潮霉素B做为抗性筛选标记，对隐甲藻进行基因转化的方法；该方法包括下述步骤：（1）隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定；（2）基因转化系统的建立；（3）外源基因片段的准备；（4）外源基因片段对隐甲藻的转化。利用本发明专利技术可以将外源基因导入隐甲藻细胞中，同时使用潮霉素B作为筛选标记，得到外源基因转化入隐甲藻后的工程菌株。该方法为开展隐甲藻的基因工程改造提供了重要的技术基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于工业微生物领域，具体涉及一种对生产二十二碳六烯酸隐甲藻进行基因转化的方法。
技术介绍
二十二碳六烯酸（DocosahexaenoicAcid,DHA）是人脑发育、成长的重要物质之一，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%。因此，它对胎儿和婴幼儿的大脑和视网膜的发育，以及成年人脑功能的维修等方面有着重要的作用。此外，DHA对冠心病、中风、高血压等心血管系统的疾病、神经失常、老年痴呆症和抑郁症等神经系统的疾病也有积极的影响。DHA作为一种必需脂肪酸，其增强记忆与思维能力、提高智力等作用更为显著。人群流行病学研究发现，体内DHA含量高的人的心理承受力较强，智力发育指数也高。DHA还可用于癌症治疗，抑制发炎等。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25-26.2亿美元，并且以每年15%以上的速度增长。截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。利用隐甲藻（Crypthecodiniumcohnii）发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比，具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。鉴于隐甲藻发酵生产DHA的优势，有必要发展相关的分子生物学技术对其体内积累油脂的代谢途径及其调控进行深入的研究，同时发展相关的基因工程改造策略以进一步提高隐甲藻合成DHA的产率。然而，目前针对隐甲藻尚缺乏有效的基因转化手段，使得相关的研究和提高产率的工作无法进行。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种针对隐甲藻敏感的抗生素，以及提供一种对隐甲藻进行基因转化的方法。本专利技术的技术方案如下：（1）隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定：①培养基的配制：在C9N2培养基（葡萄糖9g，酵母浸粉2g，海盐25g，加水至1L）中对潮霉素B设置浓度梯度，10mg/L-50mg/L；②潮霉素B敏感浓度的确定：隐甲藻在25℃，180rpm条件下振荡培养48h，取50μl细胞悬浮液均匀涂布在5个梯度平板上，25℃倒置培养2周（无抗平板培养作为阳性对照），最终确定隐甲藻对潮霉素B的敏感浓度为40mg/L；（2）基因转化体系的建立：①隐甲藻感受态细胞的制备：取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4℃，3500rpm离心5min，弃上清，加入1mL25mMDTT溶液，30℃水浴15min，离心5min，弃上清，10mL1M山梨糖醇（sorbitol）清洗细胞三次，1mL山梨糖醇重悬细胞备用；②荧光标记大分子FITC-Dextran（70kDa）的转化：FITC-Dextran（70kDa）是一种荧光标记的大分子物质，在进入细胞内部之后能够自发绿色荧光使细胞带有绿色荧光标记。因此，为了验证隐甲藻感受态细胞的转化效率和确定最佳的电击条件，选择荧光标记的大分子聚合物FITC-Dextran（70kDa）作为转化的分子。在无菌条件下取200μl隐甲藻感受态细胞至于2μm电极杯中，加入1μl鲑鱼精DNA和2μgFITC-Dextran混匀，冰浴5min，其中不加入FITC-Dextran的作为阴性对照，加入FITC-Dextran但不电击的作为阳性对照，设置电压1.4kV，1.6kV，1.8kV，2.0kV，2.2kV和2.4kV，电阻200Ω，电容25和50μF进行电击转化，电击结束之后在冰上冰浴5min，用2mLC9N2培养基重悬细胞并加入胰蛋白酶37℃培养30min，荧光显微镜镜检细胞，观察是否有发绿色荧光的细胞，荧光分光光度计测定转化之后细胞悬浮液的荧光值。通过比较细胞悬浮液之间荧光值的差异最终确定电击转化条件为电压2.0kV，电阻200Ω，电容25μF；（3）外源基因片段的准备：①隐甲藻18S基因上游片段的扩增：取隐甲藻基因组溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μl，10μM的dNTP0.4μl，10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl，Phusion酶0.2μl，无菌水12.4μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的上游片段；②隐甲藻18S基因下游片段的扩增：取隐甲藻基因组溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μl，10μM的dNTP0.4μl，10μM上游引物1μl、10μM下游1μl，Phusion酶0.2μl，无菌水12.4μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的下游片段；③潮霉素抗性基因（Hpt）的扩增取pCAMBIA1301植物表达载体溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μl，10μM的dNTP0.4μl，10μM上游引物1μl、10μM下游1μl，Phusion酶0.2μl，无菌水12.4μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃40s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；④用于同源双交换整合的基因片段的构建：取扩增后的隐甲藻18s上游片段、18s下游片段、以及Hpt片段各10ng为模板，5×PhusionHFbuffer4μl，10μM的dNTP0.4μl，Phusion酶0.2μl，无菌水10.4μl，以10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl，在PCR管中混匀，将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，60℃90s，72℃30s，共30个循环，4℃5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段（上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR产物）；（4）外源目的基因片段对隐甲藻的转化；①隐甲藻感受态细胞的制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对隐甲藻进行基因转化的方法，其特征是包含如下步骤：隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定：培养基的配制：    在C9N2培养基（葡萄糖9 g，酵母浸粉2 g，海盐25 g，加水至1 L）中对潮霉素B设置浓度梯度，10 mg/L‑ 50 mg/L；潮霉素B敏感浓度的确定：    隐甲藻在25℃，180 rpm条件下振荡培养48 h，取50 μl细胞悬浮液均匀涂布在5个梯度平板上，25℃倒置培养2周 （无抗平板培养作为阳性对照），最终确定隐甲藻对潮霉素B敏感浓度为40 mg/L；转化体系的建立：隐甲藻感受态细胞的制备：取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10 mL， 4℃，3500 rpm离心5 min，弃上清，加入1 mL 25 mM DTT溶液，30℃水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL 1 M 山梨糖醇（sorbitol）清洗细胞三次，1 mL 山梨糖醇重悬细胞备用；荧光标记大分子FITC‑Dextran（70 kDa）的转化：在无菌条件下取200 μl 隐甲藻感受态细胞至于2 μm电极杯中，加入1 μl 鲑鱼精DNA和2 μg FITC‑Dextran 混匀，冰浴5 min，其中不加入FITC‑Dextran的作为阴性对照，加入FITC‑Dextran但不电击的作为阳性对照，设置电压1.4 kV，1.6 kV ，1.8 kV ，2.0 kV ，2.2 kV 和2.4 kV，电阻200 Ω，电容25和50 μF进行电击转化，电击结束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培养基重悬细胞并加入胰蛋白酶37℃培养30 min，荧光显微镜镜检细胞，观察是否有发绿色荧光的细胞，荧光分光光度计测定转化之后细胞悬浮液的荧光值；通过比较细胞悬浮液之间荧光值的差异最终确定电击转化条件为电压2.0 kV，电阻200 Ω，电容25 μF；外源基因片段的准备：隐甲藻18S上游片段的扩增：    取隐甲藻基因组溶液10 ng，5×Phusion HF buffer 4μl，10 μM的dNTP 0.4 μl，10 μM上游引物 1 μl、10 μM 下游引物 1 μl ，Phusion酶0.2 μl，无菌水12.4 μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，4℃ 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的上游片段；隐甲藻18S下游片段的扩增：取隐甲藻基因组溶液10 ng，5×Phusion HF buffer 4μl，10μM的dNTP 0.4 μl，10 μM上游引物1 μl、10 μM下游1 μl，Phusion酶0.2 μl，无菌水12.4 μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，4℃ 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的下游片段；潮霉素抗性基因（Hpt）的扩增    取pCAMBIA1301植物表达载体溶液10 ng，5×Phusion HF buffer 4 μl，10 μM的dNTP 0.4 μl，10 μM上游引物1 μl、10 μM下游1 μl，Phusion酶0.2 μl，无菌水12.4 μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共30个循环，4℃ 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；用于同源双交换整合的基因片段的构建：    取已获得的隐甲藻18s上游片段、18s下游片段、以及Hpt片段各10 ng为模板，5×Phusion HF buffer 4 μl，10 μM的dNTP 0.4 μl，Phusion酶0.2 μl，无菌水10.4 μl，以10 μM 上游引物 1 μl、10 μM 下游引物 1 μl，在PCR管中混匀，将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，60℃ 90 s，72℃ 30 s，共30个循环，4℃ 5 min；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段（上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR产物）；外源目的基因片段对隐甲藻的转化；隐甲藻感受态细胞的制备：    取隐甲藻悬浮培养48 h的细胞10 mL， 4℃，3500 rpm离心5 min，弃上清，加入1 mL 25 mM DTT溶液，30℃水浴15 min，离心5 min，弃...

【技术特征摘要】
1.一种对隐甲藻进行基因转化的方法，其特征是包含如下步骤：
隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定：
培养基的配制：
在C9N2培养基（葡萄糖9g，酵母浸粉2g，海盐25g，加水至1L）中对潮霉素B设置浓度梯度，10mg/L-50mg/L；
潮霉素B敏感浓度的确定：
隐甲藻在25℃，180rpm条件下振荡培养48h，取50μl细胞悬浮液均匀涂布在5个梯度平板上，25℃倒置培养2周（无抗平板培养作为阳性对照），最终确定隐甲藻对潮霉素B敏感浓度为40mg/L；
转化体系的建立：
隐甲藻感受态细胞的制备：
取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4℃，3500rpm离心5min，弃上清，加入1mL25mMDTT溶液，30℃水浴15min，离心5min，弃上清，10mL1M山梨糖醇（sorbitol）清洗细胞三次，1mL山梨糖醇重悬细胞备用；
荧光标记大分子FITC-Dextran（70kDa）的转化：
在无菌条件下取200μl隐甲藻感受态细胞至于2μm电极杯中，加入1μl鲑鱼精DNA和2μgFITC-Dextran混匀，冰浴5min，其中不加入FITC-Dextran的作为阴性对照，加入FITC-Dextran但不电击的作为阳性对照，设置电压1.4kV，1.6kV，1.8kV，2.0kV，2.2kV和2.4kV，电阻200Ω，电容25和50μF进行电击转化，电击结束之后在冰上冰浴5min，用2mLC9N2培养基重悬细胞并加入胰蛋白酶37℃培养30min，荧光显微镜镜检细胞，观察是否有发绿色荧光的细胞，荧光分光光度计测定转化之后细胞悬浮液的荧光值；通过比较细胞悬浮液之间荧光值的差异最终确定电击转化条件为电压2.0kV，电阻200Ω，电容25μF；
外源基因片段的准备：
隐甲藻18S上游片段的扩增：
取隐甲藻基因组溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μl，10μM的dNTP0.4μl，10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl，Phusion酶0.2μl，无菌水12.4μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的上游片段；
隐甲藻18S下游片段的扩增：
取隐甲藻基因组溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μl，10μM的dNTP0.4μl，10μM上游引物1μl、10μM下游1μl，Phusion酶0.2μl，无...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘璐，刁进进，陈磊，张卫文，
申请(专利权)人：昆明藻能生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53