一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法技术

本发明专利技术公开一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，具有高生长速率的微藻隐甲藻ATCC 30556基因删除突变株的方法。其特征是包含如下步骤：(1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco基因的克隆；(2)用于同源双交换整合的基因片段的构建；(3)Rubisco基因的删除和突变株的构建；(4)隐甲藻Rubisco基因删除突变体生长特性的比较分析。利用本发明专利技术的方法定点敲除隐甲藻的Rubisco基因，能够获得异养培养条件下具有高生长速率的隐甲藻突变株，为二十二碳六烯酸(DHA)高效发酵菌种的优化筛选提供了一种新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，特别是一种高生长速率的产二十二碳六烯酸(DHA)隐甲藻突变体的构建方法，具体是构建具有高生长速率的隐甲藻基因删除突变株的方法，属于工业微生物领域，
技术介绍
二十二碳六烯酸DHA(docosahexaenoicacid)是n-3系多不饱和脂肪酸(n-3polyunsaturatedfattyacid,n-3PUFA)的一种。其含有6个不饱和键的特殊结构决定了它对人类健康有着特殊的作用和影响。人们对DHA的研究备受重视的另一个原因是发现DHA与生命现象密切相关，其在大脑的结构膜和视网膜中其中决定性的作用。截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，其特征是包含如下步骤：1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5‑二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆：采用隐甲藻的Rubisco序列(EB086308.1)设计上游引物和下游引物，以隐甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体(Thermo Fisher Scientific)并测序；2)用于同源双交换整合的基因片段的构建：①隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增：以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基...

【技术特征摘要】
1.一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，其特征是包含如下步骤：
1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco
的克隆：
采用隐甲藻的Rubisco序列(EB086308.1)设计上游引物和下游引物，以隐
甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体(Thermo
FisherScientific)并测序；
2)用于同源双交换整合的基因片段的构建：
①隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增：
以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物进
行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐
甲藻Rubisco基因的上游片段；
②隐甲藻Rubisco基因下游片段的扩增：
以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因下游片段的上游引物、下游引物进行
PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻
Rubisco基因的上游片段；
③潮霉素抗性基因片段的扩增：
以pCAMBIA1301植物表达载体为模板，hpt上下游引物进行PCR，将PCR
产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；
④用于同源双交换删除Rubisco基因的DNA片段的构建：
以隐甲藻Rubisco基因上游片段、隐甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有
hpt基因的DNA片段模板，进行融合PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，
经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段。
3)Rubisco基因的的删除和突变株的构建：
①隐甲藻感受态细胞的制备：
取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4℃,3500rpm离心5min，弃上清，
加入1mL25mMDTT溶液，30℃水浴15min，离心5min，弃上清，10mL1M
山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，1mL山梨糖醇重悬细胞备用；
②隐甲藻感受态细胞的转化：
在无菌条件下取200μL隐甲藻感...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘璐，刁进进，陈磊，张卫文，
申请(专利权)人：昆明藻能生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53