The present invention relates to the invention discloses a Rhine Chlamydomonas acyl coenzyme A synthase antisense RNA expression vector construction method, and its application in the regulation of secretion of Rhine Chlamydomonas fatty acid. The expression of antisense RNA vector sequence were SEQ ID and SEQ No.1 ID No.2, the ACS1 and ACS2 sequence design respectively from the mRNA sequence in Rhine chlamydomonas. Construction of antisense RNA expression vector can be used in the regulation of the body fat metabolism, increase green algal cell fatty acid accumulation and promote the application of green algae fatty acid secretion, the invention is to improve the efficiency of microalgae for biodiesel production, reduce the production cost of biodiesel has important significance, has great application value and prospect in the field of gene engineering technology.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及调控调控绿藻分泌脂肪酸的酰基辅酶A合成酶反义RNA表达载体及其构建方法与应用。
技术介绍
收集微藻和提取微藻内油脂的高昂成本一直阻碍微藻生物柴油的发展。随着分子生物学的发展，可通过基因工程的方法调控微藻内油脂代谢相关基因，从而获得分泌脂肪酸的高产油微藻。已有文章报道在酿酒酵母中敲除参与脂肪酸β-氧化的基因可导致细胞内自由脂肪酸的产量上升且自由脂肪酸可分泌到细胞外。其中酰基辅酶A合成酶可将脂肪酸活化成与之对应的辅酶A硫脂底物，广泛参与油脂的代谢与合成途径。2003年Michinaka等人在部分缺失ACS基因活性的酿酒酵母突变株中察到脂肪酸分泌的现象，2007年Black和DiRusso对五株单独缺失ACS基因(Δfaa1,Δfaa2,Δfaa3,Δfaa4,Δfat1)的突变株进行研究，均观察到了微量的脂肪酸分泌现象。在此基础上，2008年Scharnewski等将酿酒酵母中的FAA1和FAA4敲除，获得可向培养基...
【技术保护点】
一种莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表达载体，其特征在于，包括骨架载体和反义RNA片段，以pH124为骨架，分别以莱茵衣藻的acs1和acs2两个ACS基因的部分片段为反义RNA片段，通过双酶切方法将其反向插入pH124中，构建由Hsp70‑Rbcs2组合启动子控制的两种反义RNA表达载体pH‑acs1和pH‑acs2，所述的两个acs基因的反义RNA片段序列分别为Seq ID NO.1和Seq ID NO.2。
【技术特征摘要】
1.一种莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表达载体，其特征在于，包括骨架载体和反义RNA片段，以pH124为骨架，分别以莱茵衣藻的acs1和acs2两个ACS基因的部分片段为反义RNA片段，通过双酶切方法将其反向插入pH124中，构建由Hsp70-Rbcs2组合启动子控制的两种反义RNA表达载体pH-acs1和pH-acs2，所述的两个acs基因的反义RNA片段序列分别为SeqIDNO.1和SeqIDNO.2。
2.一种基于权利要求1所述的莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)ACS基因目的片段的获得
提取莱茵衣藻总RNA，将其反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SeqIDNO.3和SeqIDNO.4为引物对莱茵衣藻acs1的目的片段进行PCR扩增，以SeqIDNO.5和SeqIDNO.6为引物对莱茵衣藻acs2的目的片段进行PCR扩增，分别获得SEQNO.1和SEQNO.2；
2)酰基辅酶A合成酶的反义RNA载体构建
将反义RNA片段SEQNO.1、SEQNO.2和载体pH124分别用EcoRI和XhoI双酶切，并分别将反义RNA片段连接到载体pH124对应的酶切位点上，使反义RNA片段反向插入载体上，分别获得反义表达载体pH-acs1和pH-acs2。
3.根据权利要求2所述的莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表达载体的构建方法，其特征在于，所述SEQNO.3、SEQNO.4、SEQNO.5以及SEQNO.6的序列号分别为：
SEQNO.3：5’cggaattcGTCGGCGTCCGCGGCGGCGCC(EcoRI)3’；
SEQNO.4：5’ggggtaccATGGAGCCGGCCCGCCCGGCTGGT(KpnI)3’；
SEQNO.5：5’cggaattcCACCGTCAGCATGGTGGGCAGCA(EcoRI)3’；
SEQNO.6：5’ggggtaccATGGCCCCGACAGCGGGG(KpnI)3’。
4.一种莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表达载体的应用，其特征在于，应用所述反义表达载体pH-acs1和pH-acs2构建的工程藻可被光强或者温度等手段诱导，诱导后反义RNA能显著降低靶基因水平，进而调控胞内的油脂代谢和胞外的脂...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄瑛，宋燕子，胡章立，贾彬，吴敏，林柏成，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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