采用De novo转录组分析鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过De novo转录组测序，转录本拼接和差异表达分析，鉴定蔻氏隐甲藻中与二十二碳六烯酸(DHA)生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因的方法。具体步骤包括：(1)对隐甲藻进行DHA发酵培养；(2)收集不同生长和DHA积累阶段的菌体并进行RNA提取与转录组Illumina深度测序；(3)测序数据的分析与预处理；(4)对拼接后的转录组进行功能注释与相关性统计分析，鉴定发现隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶，并获得其基因全长序列；(5)通过qRT‑PCR分析技术，对隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶的基因进行表达验证。发明专利技术为研究隐甲藻DHA的生物合成机制以及提高隐甲藻中DHA合能力成提供重要的方法和知识基础。

A method for identification of fatty acid desaturase genes related to DHA biosynthesis in dinoflagellate species using De novo transcriptome analysis

The invention discloses a De novo by transcriptome sequencing, analysis the expression of transcription and splicing differences, and twenty-two carbon six acid in identification of Kou's c.cohnii (DHA) method to the saturated fatty acid biosynthetic enzyme gene. Specific steps include: (1) the c.cohnii DHA fermentation; (2) collected from different stages of cell growth and DHA accumulation and RNA extraction and Illumina depth transcriptome sequencing; (3) analysis and sequencing data pretreatment; (4) analyze the functional annotation and correlation statistics on transcriptome splicing after the identification of DHA associated with fatty acid biosynthesis in c.cohnii desaturase, and its gene sequence; (5) by qRT PCR analysis techniques related to DHA biosynthesis in c.cohnii fatty acid desaturase gene expression for verification. The invention provides an important method and knowledge base for studying the biosynthesis mechanism of DHA and improving the DHA combining ability of the dinoflagellate.

【技术实现步骤摘要】
采用Denovo转录组分析鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法
本专利技术属于生物食品领域，涉及一种鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法及其应用。
技术介绍
DHA即二十二碳六烯酸(DocosahexaenoicAcid,DHA)是人脑发育、成长的重要物质之一，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50％。因此，它对胎儿和婴幼儿的大脑和视网膜的发育，以及成年人脑功能的维修等方面有着重要的作用。此外，DHA对冠心病、中风、高血压等心血管系统的疾病、神经失常、老年痴呆症和抑郁症等神经系统的疾病也有积极的影响。DHA作为一种必需脂肪酸，其增强记忆与思维能力、提高智力等作用更为显著。人群流行病学研究发现，体内DHA含量高的人的心理承受力较强，智力发育指数也高。DHA还可用于癌症治疗，抑制发炎等。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25-26.2亿美元，并且以每年15％以上的速度增长。截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。微藻中寇氏隐甲藻由于其快速的生长速率及较高的DHA含量、几乎不含其它不饱和多脂肪酸等副产物、易于在实验室条件下大规模培养等优势，近年来在生产中的应用越来越广泛，相关的研究也越来越深入，并逐渐可以替代传统的从鱼类产品中直接提取DHA的方法。隐甲藻作为一种原始的真核单细胞微藻，其生长周期可粗划分为细胞生长阶段和稳定时期，其中稳定期是隐甲藻积累DHA的主要阶段。然而，目前隐甲藻的基因组信息尚未公布，其DHA的合成途径尚不明确，限制了工程改造寇氏隐甲藻的各种努力。在这种情况下，Denovo转录组，又称为从头测序应运而生。该方法不需要任何现有基因组信息，就可以对某个物种的全部转录本进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的全部转录本的序列信息以及不同条件下表达响应过程。因此，利用Denovo转录组来解析隐甲藻中DHA的生物合成途径，特别是脂肪酸去饱和催化机制，对进一步提高隐甲藻中DHA含量具有重要指导意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用二代测序技术illumina/solexa系统，对寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)转录组进行denovo深度测序。对测序结果进行生物信息学分析后，得到该物种转录组中全部与DHA合成相关的基因序列(全长或部分)。最终鉴定出DHA积累期在转录组水平表达量显著变化的、和DHA生物合成相关的功能基因。其过程主要包括如下步骤：(1)对隐甲藻进行DHA合成的发酵培养：将隐甲藻在含有2.0g/L酵母提取物，9.0g/L葡萄糖，25.0g/L的海水盐的培养基中25℃静态培养生长3-5天。然后以10％(v/v)的菌种接种量，接种到含50mL培养基(2.0g/L酵母提取物，25.0g/L海盐和9.0g/L葡萄糖)的250毫升锥形瓶中，并在摇床上培育2天(转速为180rpm，25℃)。随后放大接种到含100mL培养基(7.5g/L酵母提取物，25.0g/L海盐，27.0g/L葡萄糖)的500毫升锥形瓶中，并在摇床上培养三天后用于接种7.5升的生物反应器。最终以20％(v/v)的菌种接种量转入发酵罐培养(7.5g/L酵母提取物，25.0g/L海盐，27.0g/L葡萄糖)，并按照前60小时内C：N质量比2:1补料，之后改为10：1补料。并始终将葡萄糖含量控制在15-25g/L，溶氧控制在30％，温度25℃。(2)RNA提取及转录组测序：①细胞收集：在48h，72h和96h三个时间点取样，用紫外分光光度计测得不同油脂积累阶段在48h，72h和96h的OD490值，按照OD490＝5收集细胞；在4℃，7,500-8,000rpm条件下离心10min，弃去上清，之后迅速放入液氮中冷却。②RNA的提取：利用液氮研磨法对步骤(2)①收集到的菌体细胞进行充分裂解，并保证在研磨过程中始终存在液氮。随后将研磨好的菌体分别加入到1.5mL离心管中，利用RNeasyPlantMiniKit试剂盒和DNaseI对隐甲藻的转录组进行纯化提取。③测序文库的构建：利用NanoDrop和1％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)②获得的各样品进行质量检测，并利用Ribo-ZeroTMrRNAremovalKit(PlantLeaf)对质量检测合格的样品进行核糖体RNA的去除。随后利用ProtoScriptII反转录酶和随机引物以及ActinomycinD对第一条cDNA链进行合成，利用SecondStrandSynthesisEnzymeMix对第二条cDNA链进行合成。随后将AxyPrepMagPCRClean-up(Axygen)纯化后的双链cDNA进行末端修复与A尾的连接，并收集长度至360bp之内的转录本进行文库的构建。③文库测序：根据测序仪IlluminaHiSeq2500的说明，步骤(2)③获得的各样品进行2*150bp的Paired-end(PE)测序，其中图像分析与碱基判断根据HiSeqControlSoftware(HCS)+OLB+GAPipeline-1.6(Illumina)完成，共计产生214,142,690条原始的reads。(3)数据分析与处理：①测序数据质量控制：利用NGSQCToolkit软件对步骤(2)获得的各个样品进行数据过滤：1：去除引物序列；2：去除read5’端前5bp的碱基；3：去除read3’端质量值低于30的碱基。②数据拼接：利用Trinity软件对步骤(3)①获得的样品数据进行合并进行denovo拼接，其中min_cov参数设置为2，其余参数为默认参数。③定量分析与过滤：利用RSEM软件分别将步骤(3)①获得的样品数据比对到步骤(3)②得到的拼接结果中，进行转录本定量分析。随后将潜在的噪音序列(在三个样本中最大FPKM值小于1，或最大比对reads数小于10的转录本剔除)，最终得到87,911个转录本和82,106个Unigenes。随后利用Transdecoder软件对潜在的编码蛋白进行预测。(4)基因功能注释与统计分析：①功能注释：利用BLAST软件对对步骤(3)③获得的转录本在NR,NT,KEGG,SWISSPORT和GO等数据库中以E-value<1e-5为阈值进行功能注释。根据注释信息，筛选到大量的脂肪酸去饱和酶的序列信息及相对表达量。②相关性的统计分析：用R软件对步骤(4)①获得的各样本中的脂肪酸去饱和酶相对表达量进行对应分析，找到各样本和脂肪酸去饱和酶表达的关系；在对应分析图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大；同时，图中各个相关转录本用黑色三角表示，距离中心点越远的转录本，其在不本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于二代测序技术的寻找隐甲藻中与DHA生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤：1)对隐甲藻进行DHA合成的发酵培养：将新鲜隐甲藻细胞在7.5L的发酵罐中进行补料培养，收集不同生长阶段的隐甲藻细胞进行分析，发现隐甲藻具有显著油脂积累差异特征的阶段，确定最佳样本时期；2)样本收集,RNA提取及转录组测序：对步骤(1)所获取差异油脂含量和成分的隐甲藻细胞，利用德国Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit试剂盒进行微生物细胞总RNA的抽提操作，并利用Ribo‑Zero

【技术特征摘要】
1.基于二代测序技术的寻找隐甲藻中与DHA生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤：1)对隐甲藻进行DHA合成的发酵培养：将新鲜隐甲藻细胞在7.5L的发酵罐中进行补料培养，收集不同生长阶段的隐甲藻细胞进行分析，发现隐甲藻具有显著油脂积累差异特征的阶段，确定最佳样本时期；2)样本收集,RNA提取及转录组测序：对步骤(1)所获取差异油脂含量和成分的隐甲藻细胞，利用德国Qiagen公司的RNeasyPlantMiniKit试剂盒进行微生物细胞总RNA的抽提操作，并利用Ribo-ZeroTMrRNAremovalKit(PlantLeaf)去除残余rRNA，并分别进行cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成、SPIA扩增、扩增产物的分离纯化，最终得到cDNA文库；3)转录组测序及数据分析：对步骤(2)所获取的RNA测序文库，使用美国Illumina公司的HiSeq2500测序仪，按照说明...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫文，陈磊，裴广胜，刘璐，
申请(专利权)人：昆明藻能生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53