一种富油新绿藻的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种富油新绿藻的遗传转化方法，包括如下步骤：S1.携带双元表达载体农杆菌准备；S2.富油新绿藻细胞的准备；S3.共培养：将S1保存的农杆菌转移到液体培养基中培养到对数生长期，将得到的农杆菌细胞与S2得到的藻细胞混合培养；S4.转化子筛选：收集S3共培养后的细胞，再用液体培养基将藻细胞制成细胞悬液，涂布于含潮霉素的筛选平板上，连续光照培养直到长出藻落，计数平板上长出的藻落数，挑取长出的藻落转移保存、检测。本发明专利技术对一种新的宿主富油新绿藻实现了转基因操作，对各步骤参数进行了优化限定，为富油新绿藻的基因工程操作开辟了道路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微藻基因工程
，具体地，涉及一种富油新绿藻的遗传转化方法。
技术介绍
富油新绿藻（Neochlorisoleoabundans）是1962年从沙漠中分离得到的一株淡水藻，经鉴定为绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，绿球藻科，新绿藻属（Neochloris)的一种单细胞真核绿藻。这种藻具有高产油脂能力，脂质含量可达到干重的17.5~54%，其中的三脂肪酰甘油酯占总脂质含量的80%，而且其脂肪酸组成中大多数是16~18碳的饱和或单不饱和脂肪酸。所以，很适合做生物柴油的资源。这种微藻的油酸含量很高，占总脂肪酸的35%左右。在国外，有人研究发现这种微藻具有很高的营养价值，并且用其作为贻贝等的水产动物的饵料。因此，富油新绿藻是一种很有价值的微藻藻种。有关微藻油脂积累的机理是研究人员十分关注的问题，目前比较明确的是营养胁迫机制。一般，营养源缺乏又会导致微藻细胞生长不良，最终影响总的油脂产量不高。因此，研究人员开始关注是否有可以通过基因工程的手段来促进微藻的油脂合成，比如干预微藻细胞的代谢调节机制，促进细胞内油脂合成，还有人在寻找油脂合成相关基因表达的调节子，这些努力都涉及到微藻的基因工程问题。富油新绿藻在被发现以后一直几乎没人关注，直到2008年李雁群等报道其产油机理后才开始得到逐渐广泛的关注。但是人们主要还是在形态学、培养技术、细胞采收、油脂提取等方面开展研究，还没有基因工程方面的报道。微藻是门类繁多，差异巨大，生物学性质十分复杂的生物类群，是具有微小结构（单细胞结构）和光合作用能力的生物。目前，绿藻门微藻基因工程研究较多的是莱茵衣藻、小球藻和杜氏盐藻等，但是富油新绿藻却没有任何基因工程的报道。在基因工程中，外源基因的遗传转化是一个关键步骤。目前，对于微藻常用的基因转入细胞的方法有农杆菌介导法、电击法、基因枪法、珠磨法、PEG介导法等技术。电击法、基因枪法、珠磨法是通过机械作用使质粒穿过藻细胞壁和细胞膜而进入细胞，这种方法目标DNA得到有效重组的概率较低，基因工程的整体成功率不高。PEG介导法在像富油新绿藻这类有细胞壁的绿藻中应用时，需要先将细胞制成原生质体，这种技术不仅和机械法一样有重组率低的问题，还有原生质体再生困难的问题。农杆菌介导法，是利用农杆菌的Ti质粒可以将一段DNA序列（T-DNA）重组到宿主细胞核DNA中的性质，通过将要表达的外源DNA序列重组到T-DNA序列中，然后将带有需要转化的外源DNA序列的质粒的农杆菌与微藻共培养从而使目标DNA序列转化到宿主细胞中。这种方法的优点是外源DNA重组的可靠性强。农杆菌介导的基因转化，在高等植物研究中被广泛采用。2004年Kumar首次利用农杆菌介导法在莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardti）转基因获得成功后，陆续有报道在雨生红球藻（HaematococcusPluvialis），裂殖壶菌（Schizochytrium），杜氏盐藻（Dunaliellasalina）和普通小球藻（Chlorellavulgaris）上用农杆菌介导法获得成功。但是经专利技术人的前期研究发现，文献上现有的方法不适合富油新绿藻的遗传转化。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，通过农杆菌介导法有效转化外源基因于富油新绿藻中，提供了一种富油新绿藻的遗传转化方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。一种富油新绿藻的遗传转化方法，包括如下步骤：S1.携带双元表达载体农杆菌准备：将重组的pCAMBIA1301质粒转入感受态农杆菌中，再将转化后的农杆菌涂布于培养平板上培养，挑选出成功转入了质粒的农杆菌，转移到固体培养基保存；S2.富油新绿藻（Neochlorisoleoabundans）细胞的准备：培养富油新绿藻细胞到对数生长期，离心，得到藻细胞，用于共培养；S3.共培养：将S1保存的农杆菌转移到液体培养基中培养到对数生长期，将得到的农杆菌细胞与S2得到的藻细胞混合培养；S4.转化子筛选：收集S3共培养后的细胞，再用液体培养基将藻细胞制成细胞悬液，涂布于含潮霉素的筛选平板上，连续光照培养直到长出藻落，计数平板上长出的藻落数，挑取长出的藻落转移保存、检测；其中，S1所述重组的pCAMBIA1301质粒包含Hsp70A-RBCS2启动子+GUS基因+RBCS2终止子的表达盒和CaMV35s启动子+hygromycin基因+CaMV35spolyA终止子的表达盒。所述质粒保存在大肠杆菌中，先培养大肠杆菌，提取质粒用于转化到农杆菌中。富油新绿藻获得了潮霉素抗性，说明潮霉素基因转化成功。对转化子进行PCR检测，可以进一步证明潮霉素基因已经转化成功。收集的转化子细胞还可以通过PCR检测证明GUS基因转化成功，通过GUS组织化学染色可以直观观察GUS基因转化成功并得到表达。目前报道的农杆菌介导的转基因技术中，外源基因表达采用的启动子大多用CaMV35s启动子，本专利技术的实验发现用更适合绿藻的Hsp70A-RBCS2启动子更有利于在富油新绿藻中表达外源基因，可以获得更高的转化率。专利技术人发现，改变重组的pCAMBIA1301质粒将导致所述富油新绿藻的转化率降低。并且，现有技术中通常采用在黑暗中共培养，或者采用周期光照共培养，经本专利技术的实验发现，采用连续光照可以得到更高的转化率和更短的培养周期。本专利技术所述方法的关键点在于针对一种新的宿主富油新绿藻实现了转基因操作，对各步骤参数进行了优化限定，为富油新绿藻的基因工程操作开辟了道路。优选地，S2所述培养富油新绿藻所用的培养基为改良SE培养基，培养基配方为：NaNO30.51-1.70g/L,K2HPO4·3H2O0.15g/L,MgSO4?7H2O0.15g/L,CaCl2?2H2O0.05g/L,KH2PO40.35g/L,NaCl0.05g/L,FeCl3?6H2O0.01g/L,H3BO32.86mg/L,MnCl2?4H2O1.81μg/L,(NH4)6Mo7O24?4H2O39μg/L,ZnSO4?7H2O220μg/L,CuSO4?5H2O79μg/L。改良SE培养基的特征在于比普通常用的SE培养基的营养更丰富，特别是氮源浓度大幅度增加。目前报道的小球藻、杜氏盐藻和莱茵衣藻等绿球藻科的微藻在转基因操作时所采用的培养基是普通常用的培养基，本专利技术的实验发现用高氮源含量的营养加富的改良SE培养基用于过程中的微藻培养，更加适合富油新绿藻的转基因操作。优选地，S2所述富油新绿藻在培养至细胞浓度达OD6001.0~3.0的对数生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富油新绿藻的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1. 携带双元表达载体农杆菌准备：将重组的pCAMBIA1301质粒转入感受态农杆菌中，再将转化后的农杆菌涂布于培养平板上培养，挑选出成功转入了质粒的农杆菌，转移到固体培养基保存；S2. 富油新绿藻（Neochloris oleoabundans）细胞的准备：培养富油新绿藻细胞到对数生长期，离心，得到藻细胞，用于共培养；S3. 共培养：将S1保存的农杆菌转移到液体培养基中培养到对数生长期，将得到的农杆菌细胞与S2得到的藻细胞混合培养；S4. 转化子筛选：收集S3共培养后的细胞，再用液体培养基将藻细胞制成细胞悬液，涂布于含潮霉素的筛选平板上，连续光照培养直到长出藻落，计数平板上长出的藻落数，挑取长出的藻落转移保存、检测；其中，S1所述重组的pCAMBIA1301质粒包含Hsp70A‑RBCS2启动子+GUS基因+RBCS2终止子的表达盒和CaMV35s启动子+ hygromycin基因+ CaMV35s poly A终止子的表达盒。

【技术特征摘要】
1.一种富油新绿藻的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.携带双元表达载体农杆菌准备：将重组的pCAMBIA1301质粒转入感受态农杆菌中，
再将转化后的农杆菌涂布于培养平板上培养，挑选出成功转入了质粒的农杆菌，转移到固
体培养基保存；
S2.富油新绿藻（Neochlorisoleoabundans）细胞的准备：培养富油新绿藻细胞到对
数生长期，离心，得到藻细胞，用于共培养；
S3.共培养：将S1保存的农杆菌转移到液体培养基中培养到对数生长期，将得到的农
杆菌细胞与S2得到的藻细胞混合培养；
S4.转化子筛选：收集S3共培养后的细胞，再用液体培养基将藻细胞制成细胞悬液，涂
布于含潮霉素的筛选平板上，连续光照培养直到长出藻落，计数平板上长出的藻落数，挑取
长出的藻落转移保存、检测；
其中，S1所述重组的pCAMBIA1301质粒包含Hsp70A-RBCS2启动子+GUS基因+RBCS2终止
子的表达盒和CaMV35s启动子+hygromycin基因+CaMV35spolyA终止子的表达盒。
2.根据权利要求1所述的富油新绿藻的遗传转化方法，其特征在于，S2所述培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雁群，张茜，朱宏波，谭瑜，C·Q·兰，卢虹玉，吉宏武，洪鹏志，胡雪琼，苏伟明，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44