本发明专利技术涉及一种木糖醇基因工程菌及其混合转化生产木糖醇的方法，涉及生物技术领域。本发明专利技术提出构建一种木糖醇基因工程菌E.coliBL21-xdh06，该工程菌是通过PCR方法，从氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)获得木糖醇脱氢酶（xylitoldehydrogenase，XDH）基因xdh，将其克隆并在宿主菌E.coliBL21进行稳定高效表达。该基因工程菌表达的木糖醇脱氢酶，其酶活性提高了10倍，利用该基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇，D-阿拉伯糖醇的转化率由29%提高到91.6%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，涉及一种木糖醇基因工程菌的构建及其用于混合转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。
技术介绍
木糖醇是一种五碳糖，其化学名称为1，2，3，4，5—戊醇，分子式为C5H12O5,是一种白色结晶或结晶性粉末，它的溶解度、溶液密度和折光系数等理化性质与蔗糖基本相同，可以作为蔗糖的替代品。木糖醇是一种具有较高营养价值的天然甜味物质，同时也是一种低能量甜味剂。木糖醇是人体糖类代谢的中间体，食用后不消耗胰岛素，并且木糖醇具有特殊的防龋功能，可作糖尿病人的营养剂、治疗剂及儿童防龋食品，同时木糖醇还具有降低血糖 浓度、促进钙吸收等多种功能。目前，木糖醇工业生产主要采用化学酸化催化加氢法和利用微生物直接发酵半纤维素水解液生产木糖醇，这两种方法的原料多来源于富含多缩戊糖的玉米芯、甘蔗渣等农副产品，这些原料首先经过高温水解后成为含大量木糖的水解液，因此存在酸碱消耗高、环境污染严重、工艺复杂等问题。全生物法制备木糖醇的研究已经引起了全球的关注，但是在自然界中还没有发现直接发酵葡萄糖生产木糖醇的微生物。1969年，Onishi和Suzuki首先报道了通过三步发酵将葡萄糖转化为木糖醇，首先利用Ostnophilic将葡萄糖转化为D-阿拉伯糖醇,再利用Acetic acid bacteria将生成的D-阿拉伯糖醇氧化成D-木酮糖，之后D-木酮糖被一种酵母还原为木糖醇，但是其转化率非常低，后续发酵过程复杂。我们利用氧化葡糖杆菌{Gluconobacter oxydans)将D-阿拉伯糖醇氧化还原为木糖醇，氧化葡糖杆菌购自中国微生物菌种保藏中心，编号=CGMCCl. 110，该菌同时具有D-阿拉伯糖醇脱氢酶(AraDH)和木糖醇脱氢酶(XDH)活力，能够将D-阿拉伯糖醇大部分氧化为木酮糖，而XDH的活力相对较低，木糖醇的生成量就远远小于D-木酮糖的量，如果以木糖醇为目的产物，如何提高XDH的活力成为研究的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株具有高木糖醇脱氢酶活力的基因工程菌大肠杆菌BL_xdh06 Escherichia coli BL_xdh06,已于2012年6月7日保藏于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO. M 2012207。本专利技术的另一个目的是提供一种具有高转化率的混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。利用氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，按照下述步骤进行(I)挑取氧化葡糖杆菌ifluconobacter斜面菌落于种子液培养基,28_37°C、100-260 rpm 振荡培养 8-20h。(2)将种子液以体积比1-10 %的接种量接种到扩大培养基，28-37°C、100-260 rpm振荡培养48-96h。(3)将(2)中的发酵液 6000-12000 rpm，4°C离心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH 6. 8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用适量的细胞转化液重悬菌体； (4)转化液转化温度为28-37 V，100-260rpm振荡转化24_60h，4h取样，4h取样，转化液中得到木糖醇。本专利技术的另一个目的是提供一种具有高转化率的混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。利用构建的基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇，D-阿拉伯糖醇的转化率由29 %提高到91. 6 %。利用上述构建的基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，按照下述步骤进行 (I)挑取氧化葡糖杆菌ifluconobacter斜面菌落于种子液培养基,28_37°C、100-260 rpm 振荡培养 8-20h。 (2)将种子液以体积比1-10 %的接种量接种到扩大培养基，28-37°C、100-260 rpm振荡培养48-96h。(3)将(2)中的发酵液 6000-12000 rpm，4°C离心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH 6. 8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用适量的细胞转化液重悬菌体； (4)将上述基因工程菌疋coli WJl\-xdh06接种于LB-Amp (LB-氨苄青霉素)培养基中，37 1振荡培养过夜，次日以1-10 %的接种量将种子液转接至新鲜LB-Amp培养基中，37°C培养至菌体光密度值约为O. 6-0. 8时，加入IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度O. 5-1. 2mmol/L进行诱导表达5_15h左右。取一定体积工程菌液6000-12000 rpm,4°C离心5-20 min，收集菌泥，用O. I mol/L pH 6. 8的磷酸钾缓冲液洗涤，菌体待用。(5)将(3)和(4)离心得到得菌体用适量的细胞转化液重悬菌体。(6)转化液转化温度为28-37 °C，100_260rpm振荡转化24_60h，4h取样，转化液中得到木糖醇。其中步骤(I)所述的种子液培养基组成如下葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L;氧化葡糖杆菌斜面培养基葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L，琼脂 10-20 g/L，其余为水。其中步骤(2)所述的扩大培养基组成如下葡萄糖20-40.0 g/L，酵母膏2-20.0g/L，胰蛋白胨1-10.0 g/L，D-阿拉伯糖醇5-20.0 g/L，碳酸钙10-20.0 g/L，其余为水。其中步骤(3)所述的细胞转化液组成如下D_阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸钙10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余为水。其中步骤(4)所述的LB-Amp培养基组成如下胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L, Amp (氨苄青霉素)50 μ g/L (终浓度)，其余为水。其中步骤(5)所述的细胞转化液包组成如下D_阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸钙10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余为水。具体实施例方式本专利技术的氧化葡糖杆菌{Gluconobacter oxydans)购自中国微生物菌种保藏中心编号CGMCC1. 110。本专利技术所述木糖醇脱氢酶基因为Christina Prus报道的序列GVatereBiotechnology 23(2)，195 - 200，2005，NC_006677. I)。通过常规的基因工程技术将木糖醇脱氢酶基因导入大肠杆菌得到含有所述木糖醇脱氢酶基因Ui*)的大肠杆菌。本专利技术的基因工程菌具有较高的木糖醇脱氢酶酶活力，酶活力达21U/mg，其酶活性提高了 10倍。包括以下步骤 I、培养氧化葡糖杆菌，提取菌株的总DNA，通过PCR扩增出目的片段。2、目的片段和表达载体通过酶切用T4连接酶连接构建重组质粒，将重组质粒导入宿主菌万.BL21 ο3、提取大肠杆菌质粒，通过PCR、双酶切和SDS-PAGE进行表达验证，证明重组菌构建成功。4、测定基因工程菌的木糖醇脱氢酶酶活力。具体过程见实施例I。实施例I、具有木糖醇脱氧闻酶活力的基因工程菌的获得 根据NCBI上发表氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶基因序列和表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种木糖醇基因工程菌大肠杆菌BL？xdh06？？Escherichia？coli？BL？xdh06，保藏编号为CCTCC？NO.？M？2012207。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：齐向辉，郭齐，王飞，邓文颖，王亮，孙文敬，陈华友，蒙健宗，张云光，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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