一种MRRP蛋白、基因、载体、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种MRRP蛋白、基因、载体、工程菌及其在制备伤口愈合药物中的应用，所述MRRP蛋白由贻贝粘附蛋白Ma1、果蝇弹性蛋白Res1、蜘蛛丝蛋白氮端序列Nt1、蜘蛛丝蛋白中段重复序列SSR、蜘蛛丝蛋白碳端序列Ct1、果蝇弹性蛋白Res2和贻贝粘附蛋白Ma2顺次连接构成；本发明专利技术MRRP蛋白集成了蜘蛛丝蛋白的自组装性能、果蝇弹性蛋白高弹性能和贻贝粘附蛋白的高粘性能，综合性能优异，且长度均一，可完全生物降解，微生物法制备产量高、不存在化工污染；MRRP具有高粘弹性，可以粘合伤口，实现伤口的无线粘合。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种蛋白类生物高分子MRRP及其应用。(二)
技术介绍
近年来多种性能优异的生物来源多肽、长肽和蛋白质被研究人员所发现。硅沉积肽、钙结合肽段、壳聚糖结合肽段、蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝粘蛋白、节肢动物弹性蛋白以及贝壳粘附蛋白等大量性能优异的新型蛋白类材料受到材料学研究的重视。由于化学合成法的限制，当前蛋白类生物材料研究，多采用先合成小肽，而后通过小肽多级自组装形成较大药物负载复合体的研究思路。基因工程法是进行蛋白质外源表达的常用方法，其所产目标蛋白为单一长度产物，不存在化学合成所带来的副产物，且产物长度可达到数千氨基酸残基，合成能力远超化学合成，同时生产成本也远低于化学合成。因此采用基因工程法制备蛋白类生物材料的最佳选择，当前相关研究还较少。本专利技术选取具有pH响应自组装性能的蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt)，蜘蛛丝蛋白碳端序列(Ct)，蜘蛛丝蛋白中部重复序列(SSR)，具有高弹性能的果蝇弹性蛋白(Res)部分序列和具有高粘附性能的贻贝黏附蛋白(Ma)部分序列为目标功能肽段，借助基因融合技术，形成由贻贝粘附蛋白(Ma1)、果蝇弹性蛋白(Res1)、蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt1)、蜘蛛丝蛋白中段重复序列(SSR)、蜘蛛丝蛋白碳端序列(Ct1)、果蝇弹性蛋白(Res2)和贻贝粘附蛋白(Ma2)等7个嵌段顺次连接构成的新型蛋白类生物高分子MRRP，其长度为905个氨基酸残基。MRRP为人工将3r>个远源物种(蜘蛛、果蝇和贻贝)来源的功能肽段融合形成的全新生物高分子。由于自然生殖隔离的存在，没有理论支持本专利技术MRRP蛋白可能存在于任何已知生物体中的可能性。该7嵌段MRRP具有优异的粘附性能、弹性和pH响应自组装性能，可体外形成形式多样的生物医用材料，在诸多生物医用领域，尤其是医学缝合和伤口外敷方面具有突出的应用潜力，在生物医药领域具有广阔的应用前景。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种性能优异的生物医用高分子，具体为蛋白类生物高分子MRRP，以及在制备伤口愈合药物中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种MRRP蛋白，所述MRRP蛋白为人工设计制备的跨物种融合蛋白，来源物种为蜘蛛、果蝇和贻贝，具体本专利技术选取具有pH响应自组装性能的蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt)，蜘蛛丝蛋白碳端序列(Ct)，蜘蛛丝蛋白中部重复序列(SSR)，具有高弹性能的果蝇弹性蛋白(Res)部分序列和具有高粘附性能的贻贝黏附蛋白(Ma)部分序列为目标功能肽段，借助基因融合技术，形成MRRP蛋白，所述MRRP蛋白是由贻贝粘附蛋白(Ma1)、果蝇弹性蛋白(Res1)、蜘蛛丝蛋白氮端序列(Nt1)、蜘蛛丝蛋白中段重复序列(SSR)、蜘蛛丝蛋白碳端序列(Ct1)、果蝇弹性蛋白(Res2)和贻贝粘附蛋白(Ma2)共7个嵌段顺次连接构成，长度为905个氨基酸残基，所述MRRP蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术由于蜘蛛、果蝇和贻贝间存在自然条件下不可能逾越的生殖隔离，因此没有理论依据支持可能存在天然的本专利技术所述融合蛋白MRRP。本专利技术还提供一种所述MRRP蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。所述MRRP蛋白的编码基因序列为非天然基因序列，是经过密码子改造并由人工合成的全新基因序列。由于构成MRRP的7个天然肽段存在大量大肠杆菌稀有密码子，且具有较高的甘氨酸和丙氨酸比例，不适合直接在大肠杆菌中表达。因此，本专利技术对MRRP的基因密码子进行了优化，移除了所有稀有密码子，并对甘氨酸和丙氨酸密码子进行了均衡分配，最后通过全基因合成法获得新型人造蛋白类高分子MRRP的基因。同样由于生殖隔离的存在，没有理论依据支持可能存在天然的本专利技术所述编码MRRP的基因。本专利技术涉及一种由所述编码基因构建的重组载体，所述MRRP表达载体的构建方法为：将SEQIDNO.2所示核苷酸序列插入质粒PUC57的EcoRⅤ位点，表达元件为Lac启动子、Lac操纵子、Lac核糖体结合位点(RBS)和T7终止子，全表达框长度为3005bp，对应的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。本专利技术涉及一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌的构建方法为：将SEQIDNO.3所示核苷酸序列导入宿主菌内(优选大肠杆菌DH5α菌株)，经表达纯化，获得重组基因工程菌。本专利技术所述MRRP蛋白的制备方法为：将含MRRP蛋白编码基因的重组基因工程菌接种至自诱导培养基，培养温度为16～40℃，培养时间为12～24h，将培养液离心，收集菌体，并重悬于细胞破碎缓冲溶液(50mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，pH5.5，溶剂为去离子水)中，超声破碎(130W的功率，超声4s，停歇6s的工作方式，超声破碎30min)，然后再次离心，收集上清液，最后将上清液过阳离子柱并以含终浓度300～1000mM氯化钠和0.5～3.0M尿素的细胞破碎缓冲液进行梯度洗脱，经目标洗脱峰粘附试验收集MRRP洗出液，经透析(优选排阻分子量为14kDa的透析袋)和冷冻干燥，获得MRRP蛋白；自诱导培养基配方为：酵母抽提物2.0～6.0g/L，胰蛋白胨5.0～10.0g/L，酪蛋白胨5.0～10.0g/L，葡萄糖0.1～2.0g/L，磷酸氢二钾4.0～8.0g/L，磷酸二氢钾3.0～9.0g/L，磷酸铵2.0～5.0g/L，硫酸镁0.2～1.5g/L，氯化钙2.0～6.0mg/L，氯化钴0.5～4.0mg/L，氯化铜0.5～2.0mg/L，硫酸锰1.0～8.0mg/L，钼酸钠3.0～7.0mg/L，硼酸0.1～0.6mg/L，氯化铁1.0～7.0mg/L，氯化锌0.5～2.5mg/L，甘油1.0～10.0g/L，丝氨酸0.5～2.0g/L，甘氨酸2.0～8.0g/L，丙基硫代-β-D-半乳糖苷24-320mg/L，溶剂为去离子水，pH7.0。目标洗脱峰粘附试验做法为：取洗脱峰流出液20μL与20μL浓度为1M，pH为7.5的Tris溶液混合均匀，并滴于载玻片表面，于25℃下密封保湿孵育12h，然后以蒸馏水冲洗5次，并以考马斯亮兰染液进行染色，着染蓝色的洗脱峰样品即为MRRP目标洗脱峰。本专利技术还提供一种所述MRRP蛋白在制备伤口愈合药物中的应用，具体所述的伤口愈合药物为：将MRRP蛋白溶于体积浓度1％醋酸水溶液中，配成100mg/mL的蛋白溶液；然后将蛋白溶液与500mM、p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MRRP蛋白，其特征在于所述MRRP蛋白由贻贝粘附蛋白Ma1、果蝇弹性蛋白Res1、蜘蛛丝蛋白氮端序列Nt1、蜘蛛丝蛋白中段重复序列SSR、蜘蛛丝蛋白碳端序列Ct1、果蝇弹性蛋白Res2和贻贝粘附蛋白Ma2顺次连接构成。

【技术特征摘要】
1.一种MRRP蛋白，其特征在于所述MRRP蛋白由贻贝粘附蛋白Ma1、
果蝇弹性蛋白Res1、蜘蛛丝蛋白氮端序列Nt1、蜘蛛丝蛋白中段重复序列SSR、
蜘蛛丝蛋白碳端序列Ct1、果蝇弹性蛋白Res2和贻贝粘附蛋白Ma2顺次连接
构成。
2.如权利要求1所述MRRP蛋白，其特征在于所述MRRP蛋白的氨基
酸序列为SEQIDNO.1所示。
3.一种权利要求1或2所述MRRP蛋白的编码基因，其特征在于所述
MRRP蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。
4.一种由权利要求3所述编码基因构建的重组载体。
5.一种由权利要求4所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
6.一种权利要求1所述MRRP蛋白的制备方法，其特征在于所述的方
法为：将含MRRP蛋白编码基因的重组基因工程菌接种至自诱导培养基，培
养温度为16～40℃，培养时间为12～24h，将培养液离心，收集菌体，并重悬
于细胞破碎缓冲溶液中，超声破碎，然后再次离心，收集上清液，最后将上
清液过阳离子柱并以含终浓度300～1000mM氯化钠和0.5～3.0M尿素的细胞破
碎缓冲液进行梯度洗脱，收集含目标蛋白的洗出液，经透析和冷冻干燥，获
得MRRP蛋白；所述自诱导培养基配方为：酵母抽提物2.0～6.0g\...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙燕，卢陈杰，刘欢欢，李玉儒，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33