富集重镉的基因工程菌及其构建和应用制造技术

发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及镉富集基因工程菌及其构建和应用，具体是指镉富集基因工程菌构建及其构建得到的一株菌株，还涉及该菌株的镉耐受和镉吸收等功能的表征。采用本发明专利技术所述的构建方法得到的一株富集重镉的基因工程菌，其分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）KT2440-SpPCS，其保藏编号为：CCTCCNO：M?2012435。其构建过程主要是通过分子生物学手段在恶臭假单胞菌KT2440中异源表达粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）植物螯合肽合成酶基因SpPCS，本发明专利技术得到的基因工程菌株可以作为植物促生菌，这为后续与植物配合协同修复重金属的研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及镉富集基因工程菌及其构建方法和应用，具体是指镉富集基因工程菌构建及其构建得到的一株菌株，还涉及该菌株的镉耐受和镉吸收等功能的表征。
技术介绍
由工农业生产活动产生的大量重金属对人类和生态环境造成了非常严峻的危害，例如Cd、Hg、As、Pb等，可以代替Zn、Fe、Cu以及其它的一些非重金属元素，破坏它们作为一些蛋白和酶的辅因子作用，从而干扰生物体的正常生理代谢活动。而且大部分重金属可以长期停留在环境土壤中，用传统的物理化学方法修复，包括利用化学试剂提取、电化学、就地掩埋等等，往往代价过高、效率低下，甚至会改变土壤的物理和化学结构，大大降低土壤肥力。近年来，以基因工程菌为基础的生物修复方式以其经济性和有效性等优势，正得到越来越多的重视。恶臭假单胞菌、Pseudomonas是具有很强抗逆性能的一株环境优势菌株，能够降解环境中的多种有机污染物，如甲苯，并具有一定的重金属(如Cu和Cd)耐受能力等。恶臭假单胞菌KT2440 putida KT2440)是一株模式环境微生物菌株，也是迄今遗传研究阐述得最为清晰、代谢多样性研究得最为透彻的腐生假单胞菌，且作为根际促生菌，可以与植物配合作用，增强植物在环境胁迫尤其是重金属污染中的生存能力。恶臭假单胞菌KT2440基因组在2002年被解析，是第一个被解析的恶臭假单胞菌菌株。由于其遗传操作系统简单清晰，是首选的基因克隆、表达的革兰氏阴性菌株之一。目前利用微生物修复治理土壤中的重金属污染土壤的机理包括通过菌体分泌的有机酸和氨基酸的溶解作用、微生物对重金属的生物转化作用等。而来源于裂殖酵母、低等藻类和大部分植物的植物螯合肽合成酶，在重金属离子的诱导下，可以催化低分子量的谷胱甘肽(GSH)并通过转肽反应生成相对高分子量的植物螯合肽(Y-Glu-Cys) n-Gly(n=2-ll)，后者是具有更强金属螯合能力的非蛋白巯基(NPT)多肽。研究表明，通过在E. coli中异源表达粟酒裂酵母) 5)% ! 基因和小麦J(/ ! 基因可以明显增强工程菌的耐Cd能力，并可以提高菌体中Cd的累积量(分别达到14.9μ mol/g和 7· 2 μ mol/g)。
技术实现思路
本专利技术的第一个技术目的在于提供了一株新的可以富集重金属镉的恶臭假单胞菌基因工程菌；使得本专利技术得到的基因工程菌株具有可以作为植物促生菌，可与植物配合协同修复重金属污染土壤的潜力。本专利技术的第二个技术目的在于提供上述基因工程菌株的构建方法，该构建方法是一种在恶臭假单胞菌KT2440中异源表达粟酒裂殖酵母pombe)植物螯合肽合成酶基因的基因工程方法。3本专利技术的第三个技术目的在于上述基因工程菌株在配合植物协同修复土壤重金属污染中的应用。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术采用以下技术方案。一、采用本专利技术所述的构建方法得到的一株富集重镉的基因工程菌，其分类命名为恶臭假单胞菌iPsGudomoims putida ) KT2440_SpPCS，其保藏编号为CCTCC NO M2012435。二、本专利技术所述的可恶臭假单胞菌iPsGudomorms putida)KT2440-SpPCS的构建方法以环境模式菌株恶臭假单胞菌iPseudomonas putida ) KT2440为出发菌,重组表达粟酒裂殖酵母基因获得可以富集重金属镉的目标基因工程菌。具体步骤如下1)以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模板，PCR扩增出分基因，经T-A克隆连接到测序载体PMD19-T Simple质粒，挑正确的转化子，经测序，比对正确，得到包含表达基因SpPCS的中间质粒PMDig-T-^/^y ；2)设计酶切位点将分插入到表达质粒pBBRlMCS-5载体的相应的酶切位点之间、连接获得重组质粒pBBRlMCS-5-分；3)将构建好的重组质粒pBBRlMCS-S-^/^y电击转化导入到恶臭假单胞菌KT2440的感受态细胞中，经50 μ g/mL的庆大霉素筛选得到阳性转化子即恶臭假单胞菌iPseudomonas)KT2440-SpPCS。三、本专利技术所述镉富集基因工程菌的应用，具体地，是指在恶臭假单胞菌{Pseudomonas putida^) KT2440-SpPCS配合植物协同修复土壤重金属污染中的应用。对上述应用方法的验证主要包括镉耐受能力显著提高、镉富集能力明显增多、非蛋白巯基产量显著提高三步骤。(I) 镉耐受能力检测将出发菌株和本专利技术所述的重组基因工程菌株在5 mL含有相应抗性的种子液中培养过夜，分别转接至含有100 mL培养液的三角瓶中，当OD6tltl=O. 5时，加入O. 6 mM IPTG诱导，I小时后，加入500 μ M氯化镉，之后每隔两个小时在OD6c 条件下测量菌体密度。重组菌和空质粒对照在相应抗性的种子液中培养过夜，分别转接于50 mL培养液的三角瓶中，当OD600=O. 5时，加入0.6 mM IPTG诱导，当OD600=L O时，分别按1、10_2、10_4、10_6的稀释度，取100 μ L菌液涂布在不同浓度Cd2+的抗性平板上，30°C培养30小时后，取出拍照。(2)镉富集能力检测转接过夜培养的重组菌和对照空质粒菌株于25mL LB液体培养基中，当0D_=0. 5时，加入不同浓度的氯化镉溶液和O. 6mM IPTG诱导，30°C继续培养5小时，收菌，用5mM HEPES (pH 7. 1,0. 85% NaCl)细菌两次，65°C下干燥24小时，用70%的浓硝酸处理过夜，取可溶物用石墨炉原子吸收分光光度计在228. 8 nm下检测镉吸收量。(3)非蛋白巯基(NPT)检测原始菌和重组菌经O. 6 mM IPTG诱导后，I小时后加入不同浓度的氯化镉，10小时后，菌体迅速在液氮中冷却，研磨彻底破碎。取用300 mL含有I M NaOH和lmg/L NaBH4的溶液溶解，4 °〇下13000 g离心5 min，取上清用50 mL含有37% (w/v)的HCl酸化。总的NPT的检测，取10 mL样品液加入500 mL ElIman’ s试剂45，5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) ] (DTNP), 30 °C反应两分钟后，在 412 nm 处检测吸光度。本专利技术的有益效果在于本专利技术将来源于粟酒裂殖酵母pombe)的植物螯合肽合成酶基因(分/7O通过基因工程的方法成功在恶臭假单胞菌KT2440中异源表达，成功构建了对Cd污染具有一定生物修复潜力的生物工程菌，可以极大程度地提高菌体内的非蛋白巯基(NPT)含量和对重金属镉的耐受能力，经石墨炉原子吸收检测到基因工程菌可以富集更多的重金属镉，无论是对原始出发菌株KT2440和基因来源菌株而言，其实现了意想不到的效果，即首次通过广宿主载体pBBRlMCS-5在模式环境菌株恶臭假单胞菌KT2440中成功表达了粟酒裂殖酵母的植物螯合肽合成酶基因，且能一定程度上提高宿主菌的重金属镉耐受性、镉富集量和细胞内与镉螯合的巯基总量。而恶臭假单胞菌作为植物促生菌的植物促生作用可以将其与某些超积累植物或者一般的普通植物配合，以达到更好的植物修复作用。附图说明图。的镉吸收量。量。收量。比。其中，pBB:KT2440-pBBRlMCS-5-空质粒对照菌株，P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株富集重镉的基因工程菌，其分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas？putida）KT2440？SpPCS，其保藏编号为：CCTCC？NO：M？2012435。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑涛，刘伟，陈怡露，陈璞，雍晓雨，周俊，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：