本发明专利技术涉及基因工程生物，尤其微生物如大肠杆菌，具有催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的活性。所述能催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程菌，即在微生物细胞内共表达分别编码磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和尿苷二磷酸葡萄糖转移酶的3个基因；这些功能酶基因通过表达载体导入细胞得到基因工程菌。本发明专利技术的工程菌株是在添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的情况下诱导功能酶蛋白的表达，直接利用工程菌生物催化黄酮类化合物的葡萄糖苷化，同时细胞生长良好，发酵周期较短，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及利用合成生物学技术构建一种具有催化黄酮 类化合物葡萄糖苷化反应的基因工程微生物细胞。
技术介绍
黄酮类化合物广泛存在于自然界，是多种药用植物的有效成分，在植物体内多以 游离态或与糖结合成苷的形式存在；许多黄酮类化合物具有很好的抗氧化、抗炎、抗病毒、 抗肿瘤和免疫调节等生物活性，已经被用于临床，如芸香苷（rutin)有调节血管渗透性和 类似维生素P的作用，已在许多国家成为法定药物；黄苳苷（baicalin)在我国已制成注射 剂作为抗菌药应用。由于大多数黄酮苷元及部分黄酮苷类在水相中溶解度低，限制了其制 剂的开发。目前对黄酮类化合物进行分子修饰主要是以提高其在水中的溶解性为目的，而 对其水溶性改性所涉及的化学反应主要是葡萄糖苷化。因此，对黄酮类化合物的葡萄糖苷 化修饰是一种极具潜力的结构修饰技术，能促进黄酮类药物的临床应用。目前，糖苷化修饰研究最多的是葡萄糖苷化反应，其化学修饰法需要对黄酮的酚 羟基先进行酰基保护，再高选择性的脱保护基，然后与活化的糖基供体（如糖基三氯乙 酰亚胺酯）进行糖苷化反应，最后再脱去其它保护基团获得黄酮糖苷化产物（LiM，Han X,YuB.Facilesynthesisofflavonoid7-〇-glycosides.JOrgChem. 2003Aug22 ； 68(17) :6842-5)。这种葡萄糖苷化的化学修饰反应步骤复杂，收率低，副产物多，难以进行 规模化放大和生产，不具有生产实用价值。 微生物法和酶法进行葡萄糖苷化修饰反应条件温和，无需进行保护和脱保护反 应，立体和区域选择性高，可以定向高效地生物催化黄酮苷元的葡萄糖苷化修饰。 微生物细胞的葡萄糖苷化修饰：Ibrahim等利用小克银汉霉（Cunninghamella elegans)对 3 '，5-二羟基-2 '，4 '，5 '，6, 7,-五甲氧基黄酮及 3 '，5-二轻 基-2'，4'，5'，7_四甲氧基黄酮的3'位羟基进行葡萄糖苷化反应，转化率分 别在 22.2 % 和 19.4 %(IbrahimAR，MossaJS,etal.Glucose-conjugationof theflavonesofPsiadiaarabicabyCunninghamellaelegans.Phytochemist ry, 1997, 46 (7): 1193-1195)。Rao等利用錯状芽孢杆菌（Bacilluscereus)对槲皮素进 行糖基化反应，得到槲皮素-3-0-葡萄糖苷和儿茶酸（RaoKV，WeiSnerNT.Microbial TransformationofQuercetinbyBacilluscereus.ApplEnvironMicrobiol. 1981Sep； 42(3):450_2)。1(;1等利用康宁木霉（1'1'；^1?)11；13,0；[1^开，6七31.0011￥6^；[0110€卩116抑1'；[11 intoits7-0-glycosidederivativesbyMicrobacteriumoxydans(CGMCC1788)to improveitswatersolubilityandpharmacokineticproperties.ApplMicrobiol Biotechnol，2008, 81 (4) :647-57)。从非专利文献报道来看，以微生物细胞进行的葡萄糖苷 化反应，转化率相对较低，糖苷产物较复杂；为提高转化率可增加转化体系的微生物细胞浓 度，同时微生物细胞自身也产生代谢产物。因此，微生物法的产物难以分离纯化，但可以进 行规模化放大，生产应用需要优化转化产物的纯化工艺。 利用糖基转移酶的葡萄糖苷化修饰：Kim等利用融合表达了黄单胞菌 (Xanthomonascampestris)糖基转移酶（XcGT-2)的大肠杆菌细胞在含有1%葡 萄糖的50mM磷酸缓冲液（pH7. 0)催化体系中定性地检测到木犀草素（luteolin) 和槲皮素（quercetin)的3 '羟基的葡萄糖苷化反应产物（KimHJ,KimBG,Kim JA,ParkY,LeeYJ,LimY,AhnJH.GlycosylationofflavonoidswithE.coli expressingglycosyItransferasefromXanthomonascampestris.JMicrobiol Biotechnol, 2007, 17 (3) : 539-542)。Ko等利用融合表达了 蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus)糖基转移酶（BcGT-I)的细胞在含有1%葡萄糖的IOOmM磷酸缓冲液（pH7.0) 催化体系和在添加UDP-葡萄糖的纯酶催化体系可催化山奈酚（Kaempferol)、槲皮素 的3及7位羟基和木犀草素、序菜素（apigenin)、柚皮素（naringenin)的4 '及7位 羟基进行葡萄糖苷化反应（HyungKoJ,GyuKimB,Joong-HoonA.Glycosylationof flavonoidswithaglycosyItransferasefromBacilluscereus.FEMSMicrobiol Lett, 2006, 258(2) :263-268)。Lim等利用融合表达了拟南芥菜（Arabidopsisthaliana) 7 个糖基转移酶的大肠杆菌细胞或纯酶的催化体系对槲皮素进行葡萄糖苷化反应，以 UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基化位置分别在槲皮素的3、7、3'和4'位羟基，得到6个不同 的糖基化合物：槲皮素-3-0-葡萄糖苷、槲皮素-7-0-葡萄糖苷、槲皮素-3' -0-葡萄糖 苷、槲皮素_4' -〇-葡萄糖苷、槲皮素-3, 7-0-葡萄糖苷和槲皮素-7,3' -〇-葡萄糖苷，各 种槲皮素糖苷的转化率在〇. 8% -41 %，不同槲皮素糖苷的产率在0. 19-10. 9iig.mL1(Lim EK,AshfordDA,HouB,JacksonRG,BowlesDJ.ArabidopsisglycosyItransferasesas biocatalystsinfermentationforregioselectivesynthesisofdiversequercetin glucosides.BiotechnolBioeng, 2004, 87(5) :623-631)。非专利文献报道的糖基转移酶催 化反应需要活化的UDP-葡萄糖为糖基供体，但是该糖基供体价格昂贵，在很大程度上限制 了此方法的实用价值。尽管利用表达了糖基转移酶的大肠杆菌细胞能够实现黄酮类化合物 的葡萄糖苷化反应，但细胞产生活化的UDP-葡萄糖活性较低，同样难以实现规模化放大和 应用。
技术实现思路
本专利技术目的是解决黄酮类化合物葡萄糖苷化反应中活化的UDP-葡萄糖供体的合 成难题。 本专利技术另一个目的在于解决天然黄酮类苷元化合物溶解度低的问题，提供一种生 物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程微生物细胞。 本专利技术以天然或化学合成的黄酮苷元为底物，通过糖基化反应提高其水溶性，进 而改善其生物利用率，对先导物进行糖基化修饰后，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因工程菌，其特征在于：在细胞内共表达编码磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和尿苷二磷酸葡萄糖转移酶的基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，吴松，杨燕，童元峰，王慧敏，林霖，唐亮，陈成娟，刘忞之，程克棣，孔建强，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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