一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用，本发明专利技术克隆了节旋藻的亚铁血红素氧化酶

【技术实现步骤摘要】
一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用
本专利技术属于分子生物学技术和生物工程
，具体涉及一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
藻胆蛋白主要存在于红藻、蓝藻、隐藻及少数甲藻中，由脱辅基蛋白和色基组成，是色素蛋白复合体，能捕获高等植物不能利用的蓝绿光。同时藻胆蛋白具有多种功效，可作为荧光探针，食品添加剂，保健品和药品等。根据藻胆蛋白吸收光谱性质的差异，可将其分为四大类即藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白。具有光学活性的藻胆蛋白主要是由脱辅基藻胆蛋白和藻胆素共价结合而成。藻胆蛋白具有荧光活性，是因为含有色素—藻胆色素，因此藻胆色素的合成是形成有光学活性藻胆蛋白非常重要的代谢途径。藻胆色素的合成是以氨基乙酰丙酸作为前体物质开始的。氨基乙酰丙酸在胆色素原合酶(Porphobilinogensynthase)的作用下合成胆色素原，再利用胆色素原脱氨酶(Hydroxymethyl-bilanesynthase)、尿卟啉原III合酶(UroporphyrinogenIIIsynthase,UPS)、尿卟啉原III脱羧酶(UroporphyrinogenIIIdecarboxylase,UDC)、粪卟啉原III氧化酶(CoproporphyrinogenIIIoxidase,aerobic,COXae)、原卟啉原IX氧化酶(ProtoporphyrinogenIXoxidase,aerobic,POXae)数步反应生成原卟啉IX。原卟啉IX在铁离子螯合酶等酶的作用下生成血红素。血红素氧化酶(hemeoxygenase)将血红素氧化，氧化发生在IXa位点使共轭环断裂，生成胆绿素IXa，胆绿素IXa在不同的还原酶作用下产生不同类型的藻胆色素。目前，对于具荧光活性的藻蓝蛋白的异源表达的研究多集中于集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)，鱼腥藻(Anabaenasp.strainPCC7120)中。而重要经济蓝藻-钝顶节旋藻的相关基因还没有被克隆，其在合成有荧光活性藻蓝蛋白中的作用还缺乏研究。节旋藻(Arthrospira)营养丰富，富含维生素，微量元素，人体必需的8种氨基酸，蛋白含量高达60-70％。是目前公认的唯一一种人体可安全食用并具有药用价值的经济藻类。其中含有的藻蓝蛋白可作为一种天然色素应用于食品、化妆品等领域。
技术实现思路
本专利技术提供了一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用。通过本专利技术的技术方案，获得的重组表达菌株H(314)P(314)BAEF具有较高的重组藻蓝蛋白表达量。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.12909。进一步的：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQIDNo：1序列所示的hoxⅠ基因。进一步的：所述hoxⅠ基因来源于节旋藻ArthrospiraplatensisFACHB314。进一步的：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQIDNo：3序列所示的pcyA基因。进一步的：所述pcyA基因来源于节旋藻ArthrospiraplatensisFACHB314。进一步的：所述菌株H(314)P(314)经IPTG诱导表达呈现蓝绿色，在580-590nm激发波长下，在635-645nm处发射荧光。本专利技术还提供了所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：(1)克隆节旋藻ArthrospiraplatensisFACHB314的hoxⅠ基因和pcyA基因，并将其连入克隆载体pMD19-T中，分别获得质粒pMD19T-hoxⅠ(314)和pMD19T-pcyA(314)；(2)将所述质粒pMD19T-hoxⅠ(314)用BamHI和SacI进行双酶切，所述质粒pMD19T-pcyA(314)用SacⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收目的片段hoxⅠ(314)基因和pcyA(314)基因，并将二者连接入pET24a(+)表达载体中，构建出重组表达质粒pET24a-hoxⅠ(314)-pcyA(314)；(3)将所述质粒pET24a-hoxⅠ(314)-pcyA(314)转化入E.coliBL21(DE3)表达菌株，得到重组基因工程菌株H(314)P(314)。本专利技术还提供了所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)在用于制备藻蓝胆素中的应用。进一步的：将含藻蓝蛋白α与β亚基基因及色基裂合酶cpcE与cpcF基因的质粒载体pACYCDuet-uBAEF转化入所述重组基因工程菌株H(314)P(314)，获得重组表达菌株H(314)P(314)BAEF。进一步的：所述重组表达菌株H(314)P(314)BAEF的重组藻蓝蛋白表达量达1.08mg/ml以上，获得的此重组藻蓝蛋白在580nm激发波长下，在640nm处发射出藻蓝蛋白的特征荧光峰，且单位质量重组藻蓝蛋白发射出的荧光强度达140000。本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术首次克隆了节旋藻ArthrospiraplatensisFACHB314的亚铁血红素氧化酶hoxI基因及藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因pcyA，将两者连接进pET24a(+)表达载体中，构建出重组表达质粒pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)(hoxI基因与pcyA基因均来自ArthrospiraplatensisFACHB314)，并将其转化入E.coliBL21(DE3)表达菌株，以得到重组表达菌株H(314)P(314)。从而实现大肠杆菌异源表达藻蓝胆素的所有元件都来自节旋藻ArthrospiraplatensisFACHB314。经大肠杆菌异源表达的藻蓝胆素可进一步与异源表达出的藻蓝蛋白的α与β亚基结合，从而催化有荧光活性的藻蓝蛋白的生物合成。所述重组表达菌株H(314)P(314)BAEF的重组藻蓝蛋白表达量达1.08mg/ml以上，表达出的藻蓝胆素活性非常高。获得的此重组藻蓝蛋白在580nm激发波长下，在640nm处发射出藻蓝蛋白的特征荧光峰，且单位质量重组藻蓝蛋白发射出的荧光强度达140000。而且，节旋藻(Arthrospira)是人体可安全食用并具有药用价值的经济藻类，从节旋藻中提取的藻蓝蛋白可作为一种天然色素应用于食品、药品、化妆品等领域，具有广泛的市场应用前景。附图说明图1为重组体系的菌液PCR检测；其中M1为Trans2K；M2为Trans15K；1、2、3、4、5泳道分别对应重组体系H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)。图2为重组菌株藻蓝胆素的表达，其中1，2，3，4，5，6分别对应未转化菌株E.coliBL21、重组菌株H(314)、重组菌株P(314)、重组菌株H(314)P(314)、重组菌株H(6803)P(314)和重组菌株H(314)P(6803)。图3为重组菌株的SDS-PAGE电泳，其中0为未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其特征在于：其分类命名为大肠埃希氏菌

【技术特征摘要】
1.一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其特征在于：其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.12909。2.根据权利要求1所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其特征在于：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQIDNo：1序列所示的hoxⅠ基因。3.根据权利要求2所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其特征在于：所述hoxⅠ基因来源于节旋藻ArthrospiraplatensisFACHB314。4.根据权利要求1所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其特征在于：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQIDNo：3序列所示的pcyA基因。5.根据权利要求4所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其特征在于：所述pcyA基因来源于节旋藻ArthrospiraplatensisFACHB314。6.根据权利要求1所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其特征在于：所述菌株H(314)P(314)经IPTG诱导表达呈现蓝绿色，在580-590nm激发波长下，在635-645nm处发射荧光。7.权利要求1所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)的构建方法，其特征在于所述构建方法包括以下步骤：（1）克隆节旋藻ArthrospiraplatensisFACHB314的hoxⅠ基因和pcyA基因，并将其连入...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧晓南，肖东芳，张学成，徐涤，吴非，张冉，冯小亭，衣俊杰，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37