分离的稳定的藻胆体的均相制剂，其特征在于，所述藻胆体在１×ｇ的条件下２４小时内不沉降。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
藻胆体是藻胆蛋白和无色多肽的复合物，该复合物在蓝绿藻和红藻中起主要集光天线的作用。Gantt，“Phycobilisomeslight harvesting pigmentcomplexes”，BioScience，25781-788，(1975)。这些复合物的功能完整性(functional integrity)的主要标准表现在它们在藻胆蛋白成分之间进行高效能量转移，例如在Porphyridium cruentum藻胆体中从藻红蛋白(PE)转移至藻蓝蛋白(PC)，并最终转移至别藻蓝蛋白(APC)。无色多肽参与藻胆体内藻胆蛋白的装配和定位，以进行适当的稳定和能量转移。不同有机体的藻胆体具有许多共同的特性，包括(1)极高的“复合物分子量”(5-20×106道尔顿)，即，由多个分子组成的藻胆体复合物的一摩尔的重量；(2)在电磁光谱可见区域中的重复吸收最大值；(3)高摩尔吸收系数(emax＞107M-1cm-1)；(4)在藻胆蛋白成分之间高效的(＞90％)定向振动能量转移，通常从一个或多个敏化种类转移至能够发荧光的末端受体；(5)相对分离藻胆蛋白的大的斯托克(Stoke)位移；(6)藻胆蛋白成分的高量子产额；(7)在水性缓冲液中的高溶解性；和(8)含别藻蓝蛋白的核心结构。分离的藻胆体在所有的但最有利的条件下，容易地解离成游离的藻胆蛋白和各种藻胆蛋白复合物。将离子强度调低(＜0.5M磷酸盐)、低藻胆体浓度(＜1mg/ml)和低温导致藻胆体的解离。Katoh，(1988)Methods inEnzvmology 162313-318，；Gantt等，(1979)Plant Physiology 63615-620。也有报告说将藻类冷冻会导致藻胆体破坏。Gantt等，(1979)Journal of CellBiology 54313-324。藻胆体在形态学上是以称作“杆(rods)”的有序堆排列的寡聚藻胆蛋白圆盘的复合物。一般而言，一些臂状杆从也是由杆组成的核心中辐射状伸出。不同有机体的藻胆体在形态学和计量学上各不相同，具有不同数目和类型的藻胆蛋白成分和杆。一般而言，外周杆由藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)、藻红蛋白、和/或藻蓝蛋白组成，而核心由别藻蓝蛋白和关联的连接蛋白组成。作为藻胆体荧光蛋白成分的分离的藻胆蛋白已在免疫测定中用作标记物。参见Stryer等的美国专利U.S.4,520,110和Kronick等的ClinicalChemistry 291582-1586(1983)。然而，由于在分离和操作完整的藻胆体上存在困难，本领域的技术人员尚不认为，这些大分子可同样地利用。由于藻胆体可提供的信号在理论上远大于分离藻胆蛋白，因此，本领域需要有处理藻胆体的方法以使它们可在测定和其他应用中用作宿主的可检测的标志。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供可用作特异性结合测定的标记的可溶性藻胆体的制剂。本专利技术的另一目的是提供包含与配体、受体或其他有用分子共价连接的藻胆体的藻胆体缀合物的制剂。本专利技术的又一目的是提供适合在特异性结合测定中使用的固定化藻胆体的制剂。本专利技术的还有一个目的是提供用藻胆体作为可检测的标志进行测定的方法。本专利技术的这些和其他目的通过一个或多个下述实施方式实现。在本专利技术的一个实施方式中，提供了分离的和可溶性的稳定藻胆体的均相制剂。该藻胆体在1×g的条件下24小时内不沉降。而且，在1000×g的条件下离心5分钟后，55％以上的藻胆体仍留在上清液中。本专利技术的另一实施方式提供了与一分子种类共价连接的藻胆体的制剂。该分子种类选自配体、受体和信号发生分子。在本专利技术的又一实施方式中，提供了藻胆体非共价结合在多特异性的多价配体或受体上的分离的藻胆体的制剂。本专利技术的另一实施方式提供了分离的、具有完整功能的且固定在固相载体上的藻胆体的制剂。本专利技术的还有一个实施方式提供了利用分析物与特异性结合配偶体(配体或受体)特异性结合的能力测定分析物的特异性结合测定方法。如此处所提供的，用藻胆体标记分析物的类似物或分析物的特异性结合配偶体中的一个。本专利技术的这些和其他实施方式为本领域提供了用非同位素检测的方法测定分析物的极灵敏的手段。与酶标记物不同，藻胆体可定量检测而无需辅助的底物、色原、辅助因子或定时温育。最佳实施方式的详细描述本专利技术的发现是，可使藻胆体稳定、缀合或修饰。以使它们在各种测定和形式中完整地使用。尤其由于藻胆体极大的分子量、消光系数和能量转移效率以及藻胆蛋白成分的高量子产额，藻胆体提供高灵敏度的标记。在藻胆体内的定向能量转移发生在从一个或多个“敏化种类”至末端受体。敏化种类是具有可激发第二(“受体”或“发射体”)荧光团的发射峰的第一荧光团。这些能量转移在均相特异性结合测定和包含固定化藻胆体的转导物中具有应用价值。提供分离的和可溶性的稳定藻胆体的均相制剂的制备方法。藻胆体制剂的均相性可通过在1×g的条件下温育24小时不沉降来证明。溶解性可通过离心来评定。“可溶性藻胆体制剂”是指在1000×g的条件下离心5分钟后，55％以上的藻胆体仍留在上清液中。理想的是，65％、75％、85％、甚至90％以上的藻胆体在上述离心后仍留在上清液中，使用本专利技术的方法可达到这样的水平。通常，通过温和的交联处理，如使用甲醛或很低浓度的戊二醛等使藻胆体稳定化。也可使用其他中-、短-或零长度的交联剂。与天然的藻胆体相比，稳定的藻胆体即使在稀释的离子强度(＜0.5M)和蛋白质浓度(＜1mg/ml)的条件下仍稳定。此外，它们在丙三醇、蔗糖和聚乙二醇的存在下稳定。功能上完整的藻胆体在末端受体的波长时具有主要的发射峰。通过用包括但不限于半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和葡糖胺等的合适物质猝灭(quenching)稳定化反应，可往藻胆体中加入特殊的化学基团。这些化学基团可用于不同分子种类如受体、配体或信号发生分子与藻胆体的进一步偶合。还可用加入的官能团使藻胆体二聚化或多聚化，以用作稳定的可分离的复合物。连接的分子种类可以但不必须通过加入的化学基团与藻胆体缀合。此外，可在稳定化反应的过程中，可将它们与甲醛或戊二醛等直接连接。还可通过不同的间隔臂将它们连接，以改变分子种类与藻胆体之间的空间和立体化学关系。配体包括但不限于兴奋剂、拮抗剂、半抗原、抗原、药物、激素递质、辅助因子、维生素、毒素、寡聚苷酸和将这些分子的任一个与第二个分子连接而成的缀合物。受体包括但不限于抗体、抗体片段、抗体模拟物、分子识别单位、粘着分子、可溶性受体、核酸、膜受体、细胞受体和药物受体。信号发生分子包括但不限于藻胆蛋白、染料分子、胶体、荧光团、酶、发光化合物、氧化或还原化合物，甚至其他藻胆体。分子种类与藻胆体的连接可以是位点特异性的，即，与藻胆体的特定部分连接，以使本专利技术的集光性定向。这尤其可通过使用对藻胆体蛋白质成分中的一个具有特异性的多价受体，如抗体等而达到，多价受体含二个或多个与其配体的结合位点。在本专利技术中使用的多价受体可以是多特异性的，即，它们可含与二个或多个不同的配体结合的位点。因此，多特异性受体可用于将藻胆体与另一分子种类连接。还可通过蛋白质缀合领域公知的许多方法(参见本文引作参考的Tijssen1、Wong2和Pierce3以及其中的参考文献)将藻胆体与受体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗杰·S·库比乔蒂，
申请(专利权)人：罗杰·S·库比乔蒂，
类型：发明
国别省市：
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