结合藻蓝胆素ＰＣＢ的藻蓝蛋白β亚基类荧光蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种结合藻蓝胆素ＰＣＢ的藻蓝蛋白ｂｅｔａ亚基类荧光蛋白、其与链霉亲和素形成的融合蛋白及其突变体，其序列为序列１、序列２、序列３、序列４；并公开了融合链霉亲和素的荧光蛋白直接用于荧光免疫检测的方法；藻蓝蛋白ｂｅｔａ亚基保守的半胱氨酸残基可以通过硫醚键结合藻蓝胆素ＰＣＢ，通过基因工程利用大肠杆菌制备得到荧光藻蓝蛋白的ｂｅｔａ亚基，这类蛋白的光谱性质与天然藻蓝蛋白不同，同时由于带有Ｈｉｓ－ｔａｇ标记，不仅便于提纯，还有助于改善其溶解性，与链霉亲和素形成融合蛋白，可以直接用于免疫荧光检测，有利于其在各个领域中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种结合藻蓝胆素PCB的藻蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白及其应用，属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及结合藻蓝胆素PCB的藻蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白、其与链霉亲和素形成的融合蛋白及其突变体，以及利用此融合蛋白检测可溶性抗原或抗体的检测方法。
技术介绍
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC) 。 CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB) ;PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB) ;PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB) ;CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。 可以从藻类中提取得到藻蓝蛋白，并分离出其alpha和beta亚基，alpha亚基的80位半胱氨酸残基通过硫醚健共价结合藻蓝胆素PCB， beta亚基82位和153位半胱氨酸残基分别通过硫醚健共价结合藻蓝胆素PCB;也可以通过基因工程利用大肠杆菌进行生产。CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A J， Cai YA，Glazer AN. Biosynthesis ofa fluorescent cyanobacterial C_phycocyanin holo—alphasubunit in a heterologous host.Proc NatlAcad Sci USA，2001，98 (19) :10560 10565)。 CPC的beta亚基也可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产。我们发现，利用基因工程，可以得到藻蓝蛋白beta亚基82位结合藻蓝胆素PCB的荧光蛋白，其光谱性质与天然藻蓝蛋白不同(如图1、图2、图3所示)，同时还可以对其肽链氨基酸进行突变、进行有益的标记。 链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素_生物素系统，可以实现信号放大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素_生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。本专利技术通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，直接实现链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接；通过藻胆蛋白beta裂合酶能催化藻4蓝胆素与藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白及其同源蛋白质共价结合，从而生成具有优良荧光性质的链霉亲和素标记的结合PCB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质(其光谱如图4、图5所示)。此蛋白可直接应用于免疫荧光检测等领域。 免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。 该技术的主要特点是特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是非特异性染色问题尚未完全解决，技术程序也还比较复杂。同时，由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。 藻胆蛋白性质稳定，其荧光性质受到环境影响较小，适合作为荧光探针使用。本专利技术中的藻胆蛋白已经直接标记有链霉亲和素，利用间接检测法，通过生物素_链霉亲和素系统，利用链霉亲和素标记的荧光藻胆蛋白与生物素标记的抗抗体结合，从而实现对抗原的检测。生物素-链霉亲和素提高了检测的灵敏度，同时由于抗抗体的通用性，使本检测方法可以方便的用于各种抗原的检测；荧光藻胆蛋白具有优良的荧光性质，较高的荧光效率、较大波长的荧光发射峰，可以提高检测灵敏度，减少本底荧光的影响。本方法有利于荧光藻胆蛋白在免疫检测中应用的推广。 藻胆蛋白目前正逐渐在各种领域得到广泛应用，特别是在免疫荧光检测方面有很大的开发利用前景。通过改造后具有较高荧光效率、带有可利用标记的藻胆蛋白，会大大提升其在免疫荧光检测中的应用价值，这为藻胆蛋白在医药和生物工程领域的应用奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一类结合藻蓝胆素PCB的藻蓝蛋白beta亚基、其与链霉亲和素形成的融合蛋白及其突变体的氨基酸序列，并标明其色素结合位点，同时提供利用链霉亲和素标记的荧光藻胆蛋白检测可溶性抗原或抗体的免疫检测方法。这类链霉亲和素标记的结合藻蓝胆素PCB的藻蓝蛋白beta亚基具有与天然藻类中存在的藻蓝蛋白beta亚基不同的结构，并且其荧光光谱性质也有极大区别，同时，提供了此类带有链霉亲和素标记的结合藻蓝胆素PCB的藻蓝蛋白beta亚基用于检测可溶性抗原的方法它是利用抗体与抗原特异性反应、链霉亲和素可以与生物素特异结合的原理，利用链霉亲和素标记的荧光藻胆蛋白检测可溶性抗原或抗体。 为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案是5 —种结合藻蓝胆素PCB的藻蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，将藻蓝蛋白beta亚基 编码基因克隆于表达质粒，利用藻蓝蛋白beta裂合酶表达质粒以及藻蓝胆素PCB合成酶质 粒，可以在大肠杆菌中合成结合PCB的藻蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，并且标明了其色素 结合位点，该类蛋白质序列N端具有His-tag标记，但是His-tag标记不限于N端。 所述的结合藻蓝胆素PCB的藻蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白的蛋白质序列为序列 1 : 序列1 :(第130位半胱氨酸C为藻蓝胆素PCB的结合位点) 所述的结合藻蓝胆素PCB是指藻蓝胆素PCB通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合藻蓝胆素ＰＣＢ的藻蓝蛋白ｂｅｔａ亚基类荧光蛋白，其特征在于：将藻蓝蛋白ｂｅｔａ亚基编码基因克隆于表达质粒，表达得到藻蓝蛋白ｂｅｔａ亚基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵开弘，周明，佟顺刚，夏坤，
申请(专利权)人：广州天宝颂原生物科技开发有限公司，华中科技大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]