一种别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种新型荧光蛋白质的制备方法。具体为１）将别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因和藻胆素生物合成酶基因（Ｈｏｘ１和ｐｃｙＡ）克隆于同一表达载体中，得到脱辅基蛋白和色素合成酶共同的表达质粒；２）将上述表达质粒转化宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵生产别藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，用常规蛋白质纯化技术，一步纯化得到相应的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明专利技术利用生物过程生产，是一种环境友好的生产方法；该蛋白具有不同于天然蛋白的荧光特性，实现了生物技术对天然蛋白的改造。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种新型荧光 蛋白质的制备方法。
技术介绍
藻胆蛋白主要存在于原核的蓝藻、真核的红藻、隐藻和甲藻(Pyrr叩hyta)中。根据吸收光谱的不同，可将藻胆蛋白分为4大类即藻 红蛋白(phycoerythrin, PE )，藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin， PEC ), 藻蓝蛋白(phycocyanin， PC)和别藻蓝蛋白(也称异藻蓝蛋白， allophycocyanin， APC )。藻胆蛋白脱辅基蛋白含有a和p亚基。藻胆蛋白 中的色基称为藻胆素(phycobilin),藻胆素的A或D环，或A、 D两环同时 与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基通过硫醚键共价连接。藻胆素与脱辅基蛋白 共价结合形成特定的构像，使得不同种类的藻胆蛋白呈现不同的光学特性。 藻红蛋白主要吸收约560nm的可见光，发射光约580nm的荧光；藻红蓝蛋白吸 收约570nm的可见光，发射光约630nm的荧光；藻蓝蛋白吸收约620nm的可见 光，发射光约640nm的荧光；别藻蓝蛋白吸收约650 ~ 660nm的可见光，发射光 约660 670nm的荧光。藻红蛋白结合的色基为藻红胆素 (phycoerythrobi 1 in，简称PEB);藻红蓝蛋a亚基白结合的色基为藻紫胆 素(phycoviolobilin，简称PVB), |3亚基结合的色基为藻胆胆素 (phycocyanobi 1 in，简称PCB);藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白结合的色基都是藻蓝 胆素PCB。藻胆蛋白具有提高人体免疫力，促进动物细胞再生的功能；可以抑制癌细胞生长，减轻肿瘤化疗的副作用；同时也是一种无毒副作用的理想的光敏 剂；藻胆蛋白作为一种天然色素，也可以应用于食品和化妆品中。由于有强 烈的荧光特性，藻胆蛋白还可以制备成荧光探针，在免疫学、细胞生物学和 分子生物学研究中有着广泛的应用。藻胆蛋白类荧光蛋白质可用于食品、化妆品、医药和生物工程领域，目 前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723，2002. 04. 17; —种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方 法，CN1563083， 2005. 01. 12);基因工程合成别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法 (一种制备别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法，200710029673. X， 2007. 8. 9)需要 构建多个质粒先后转化,构建过程较复杂，菌种不稳定。
技术实现思路
为克服上述缺陷，本专利技术目的在于提供一种荧光蛋白质的制备方法。 为实现上述目的本专利技术釆用的技术方案为别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，包括以下步骤 1)将别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因和藻胆素生物合成酶基因(/fo;d和pc;M)克隆于同一表达载体中，得到脱辅基蛋白和色素合成酶 共同的表达质粒；2 )将上述表达质粒转化宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发 酵生产别藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，用常规蛋白质纯化技术，一步纯 化得到相应的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质。藻胆素自催化色基与脱辅基蛋白的共价结合，合成别藻蓝蛋白类荧光蛋 白质。所述表达载体为pCDFDuet -l。别藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指与 Synechocystis PCC6803或者Anabaena sp. PCC7120中别藻蓝白蛋白a亚 基的同源基因。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点1. 不需要裂合酶基因，本专利技术利用自催化方式催化脱辅基蛋白和色基 结合，生产的荧光蛋白具有和天然藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白不同的荧光特性， 其具有分子量较小，成分单一，易于交联和进入细胞.带有HIS6标签，便于 分离纯化，纯化方法简单， 一步完成.得到的的蛋白为均一单体，不是不 同亚基和聚合体的混合物.最大激发光波长为647nm，处于天然藻蓝蛋白和 别藻蓝蛋白之间。本专利技术将别藻蓝蛋白或者藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和藻 胆素生物没合成基因插入同一表达质粒，表达质粒转化宿主菌，得到相应的 工程菌，通过这种方法得到的基因工程菌生产荧光蛋白质。2. 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产新型荧光蛋白质，大肠杆 菌易于培养，生长快，可以大大缩短生产周期；与藻类相比，大肠杆菌细胞壁 易于破碎，纯化过程可以节约能源。3. 本专利技术通过大肠杆菌诱导表达，目标蛋白含量高；含有His-tag标记， 由于表达体系中没有类似蛋白，通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的 蛋白，且纯度较高。同时可以规模化发酵，高效表达新型荧光蛋白质，也便 于对荧光蛋白进行分子设计，有利于制造其它类型的新型荧光蛋白质材料。4. 本专利技术简化了质粒构建过程，构建单一质粒，菌种较稳定，可以规模化 发酵生产一种新型荧光蛋白质，该蛋白的最大发射波长在天然藻蓝蛋白和 别藻蓝蛋白之间；藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白类荧光蛋白质具有优良的荧光性 质，为了发展新型荧光探针，可以分子设计和改造藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白类荧光蛋白质;本专利技术为藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域提供了一种简单有效的新方法。 附图说明图1为本专利技术别藻蓝蛋白类荧光蛋白质和天然别藻蓝蛋白的SDS-PAGE电 泳图(其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然别藻蓝蛋白；泳道3: 别藻蓝蛋白类荧光蛋白质l)。4图2为本专利技术实施例1所得别藻蛋白类荧光蛋白1的荧光光谱。图3本专利技术别藻蓝蛋白类荧光蛋白质和天然别藻蓝蛋白的SDS-PAGE电泳图(其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然别藻蓝蛋白；泳道3:别藻蓝蛋白类荧光蛋白质2)。图4为本专利技术实施例2所得别藻蛋白类荧光蛋白2的荧光光谱。 图5为本专利技术别藻蓝蛋白类荧光蛋白质和天然别藻蓝蛋白的SDS-PAGE电泳图(其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然别藻蓝蛋白；泳道3:别藻蓝蛋白类荧光蛋白质3)。图6为本专利技术实施例3别藻蛋白类荧光蛋白3的荧光光谱。图7为别藻蓝蛋白类荧光蛋白质和天然别藻蓝蛋白的SDS-PAGE电泳图(泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然别藻蓝蛋白；泳道3:别藻蓝蛋白类荧光蛋白质4)。图8为本专利技术实施例4所得别藻蛋白类荧光蛋白4的荧光光谱。 图9别藻蓝蛋白类荧光蛋白质和天然别藻蓝蛋白的SDS-PAGE电泳图(其中泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然别藻蓝蛋白；泳道3:别藻蓝蛋白类荧光蛋白质5)。图10为本专利技术实施例5别藻蛋白类荧光蛋白5的荧光光谱。 图11为别藻蓝蛋白类荧光蛋白质和天然别藻蓝蛋白的SDS-PAGE电泳图 (其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然别藻蓝蛋白；泳道3:别藻蓝蛋白类荧光蛋白质6)。图12为本专利技术实施例6别藻蛋白类荧光蛋白6的荧光光谱。 图13为别藻蓝蛋白类荧光蛋白质和天然别藻蓝蛋白的SDS-PAGE电泳图 (其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然别藻蓝蛋白；泳道3:别藻蓝蛋白类荧光蛋白质7)。图14为本专利技术实施例7别藻蛋白类荧光蛋白7的荧光光谱。具体实施例方式下面将结合附图和实施例对本专利技术作进一步详述； 实施例l:(1)从Genebank中可以查到，藻Synechocystis sp. PCC6803的全序 列已经测定完成。Syn本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征包括以下步骤：　１）将别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因和藻胆素生物合成酶基因（Ｈｏｘ１和ｐｃｙＡ）克隆于同一表达载体中，得到脱辅基蛋白和色素合成酶共同的表达质粒；　２）将上述表达 质粒转化宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵生产别藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，用常规方法纯化蛋白质，纯化得到相应的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟杰，关翔宇，秦松，陈华新，杨雨，刘少芳，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]